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.2011年12月；31(23):4648-62.
doi:10.1128/MCB.05934-11。 Epub 2011年10月3日。

前列腺癌细胞中无配体雄激素受体增强子的动态核小体缺失区域

克劳迪娅·安德烈·维埃拉 1, 约翰·赖（John Lai）, 本杰明·伯曼, 巴鲁克·弗兰克尔, 李佳, 彼得·琼斯, 格哈德·库切
附属公司

前列腺癌细胞中缺乏配体时雄激素受体增强子的动态核小体缺失区

克劳迪娅·安德烈·维埃拉等。 分子细胞生物学. 2011年12月.

摘要

已知核小体定位在转录起始位点通过改变DNA对转录因子的可及性来调节基因表达；然而，人们对其在增强子中的作用知之甚少。我们研究了前列腺癌细胞中TMPRSS2、KLK2和KLK3/PSA雄激素受体（AR）增强子的核小体定位。令人惊讶的是，雄激素分泌培养物中的增强子模块群体在所有三个基因座中都显示出核小体缺失区域（NDR）。在雄激素分泌条件下，TMPRSS2增强子的NDR由先驱AR转录合作者GATA-2维持。雄激素治疗导致AR占据率增加，NDR增强子模块数量增加，足迹宽度不变，组蛋白H3乙酰化（AcH3）和NDR两侧核小体的二甲基化（H3K4me2）水平增加。我们的数据表明，在没有配体的情况下，AR增强子处于一种平衡状态，其中一部分模块被核小体占据，而其他模块显示NDR。我们认为雄激素治疗会导致平衡破坏，导致核小体缺失状态，而不是增强从头“重塑”。这允许组蛋白修饰物、染色质重塑物的招募，并最终激活基因。这里描述的“接受”状态有助于解释极低配体浓度下AR信号的激活。

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数字

图1。
图1。
乙酰化H3在LNCaP细胞中侧翼占据AR的调节区域。（A） 全基因组ChIP-Seq分析显示，在DHT处理的LNCaP细胞中，组蛋白H3围绕AR占据区（ARORs）富集20%。（B） 三个原型雄激素应答基因增强子处Lys-9和Lys-14乙酰化的AR和组蛋白H3（AcH3）的ChIP-Seq招募谱(TMPRSS2型,KLK2号、和KLK3号机组). 还显示了No-Ab和输入控制。（C） qPCR分析TMPRSS2型,KLK2号、和KLK3号机组用10 nM DHT治疗4小时（左侧）或16小时（右侧）后的mRNA水平。条形图显示了相对于GAPDH水平（RQ）的表达，并表示3个独立实验±SEM的平均值。*，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.01.
图2。
图2。
AR占据和组蛋白修饰在TMPRSS2型,KLK2号、和KLK3号机组使用ChIP-qPCR的增强子。（A） 通过ChIP-qPCR分析，研究了由ChIP-Seq鉴定的五个区域（黑盒子1至5），包括AR-占据（绿色）和AcH3-修饰（红色）区域。图中还显示了功能AR元件（are，绿色星）和预测的GATA-2结合位点（蓝色矩形）的位置。（B） AR、AcH3、H3K4me2和H3的位点特异性ChIP表示为输入±SEM的平均百分比，或表示为两个独立实验与H3±SEM之间的平均比率，在每种情况下，用qPCR进行两次或三次分析。P（P）使用SAS（ANOVA）计算引物集1和3之间的输入百分比值，将两个实验和PCR复制作为自变量。*，P（P）< 0.05.
图3。
图3。
核小体定位TMPRSS2型,KLK2号、和KLK3号机组通过NOMe-Seq分析确定的增强子。（A） 核小体占有率的单分子分析TMPRSS2型,KLK2号、和KLK3号机组增强剂。地图显示了GpC位点密度和增强子（绿色条）在分析区域的位置。所有三种增强子的乙醇处理对照中都存在显示甲基化酶可进入区域（茶色气泡，上面板）的DNA模块。在DHT处理后，更多的DNA模块显示出可接近性增加（茶色泡泡，底部面板）。对每100 bp选择一个并在增强子图上用箭头（A到g）指示的7个GpC位点进行了X射线检验。乙醇处理和DHT处理的样品在核小体耗竭方面存在显著差异TMPRSS2型增强子（c，P（P）=0.0012），KLK2增强子（d，P（P）= 0.03; e、，P（P）= 0.00009; f中，P（P）= 0.014; 克，P（P）=0.009）和KLK3/PSA增强子（d，P（P）= 0.004). （B） DHT治疗4小时后无法进入GpC部位的百分比。显示了每100 bp无法访问的GpC位点的平均百分比。乙醇处理的对照样品（红色曲线）在所分析的增强子区域显示出可变的可及性范围。DHT（绿色曲线）治疗扩大了范围；显示了乙醇和DHT处理样品之间可接近性的百分比增加。还显示了在ChIP-qPCR分析中使用的增强子的位置（图下的绿色条）和引物集的位置（P1到P5）。请注意，可及性峰值与ChIP-qPCR分析绘制的AR结合区域重叠。（C） DHT治疗16小时后无法进入GpC部位的百分比。DHT治疗16小时后，观察到类似的可接近性模式。
图4。
图4。
MBase I分析TMPRSS2型和KLK2号DHT治疗4小时后增强剂。（A） MNase消化样品的代表性描述。在培养物暴露于CSS 3天后，用乙醇或DHT处理LNCaP细胞4小时；用0.5或5IU的MNase I溶解细胞并消化染色质15分钟。注意，用5IU MNase处理后，单核小体（箭头，150 bp）富集，此量被选择用于进一步研究。（B） 使用从我们的ChIP分析中选择的3组引物（P2、P3和P5）对MNase处理的DNA进行qPCR分析。引物覆盖由NOMe-Seq确定的核小体缺失区域（P3）和两个核小体占据区域（P2和P5）。引物集的位置显示在增强子（绿色条）图上。注意，在乙醇处理的对照样品中观察到核小体耗竭（在图中被视为下降），这与NOMe-Seq结果一致。DHT治疗后，在P3定位的区域观察到核小体耗竭略有增加。显示了两个独立实验的平均结果。
图5。
图5。
核小体占有率的NOMe-Seq分析TMPRSS2型和KLK2号短期DHT治疗后的增强剂。在实验开始前，所有培养物均暴露于CSS中3天。（A） qPCR分析TMPRSS2型和KLK2号用10 nM DHT治疗0.5 h、2 h和4 h后的mRNA水平。表达水平（RQ）与GAPDH水平相关(n个= 2). （B和D）DHT治疗0.5小时（B）和2小时（D）后LNCaP细胞的核小体定位。增强子地图显示了GpC位点密度和增强子（绿色条）在所分析区域的位置。两个增强子（上面板）的乙醇处理对照中均存在显示M.CviPI可进入区域（茶色气泡）的DNA模块。DHT处理后，更多的模块可被甲基化酶利用（茶色气泡，底部面板）。每100 bp选择四个GpC位点，并用增强子图上的箭头（a到d）表示，使用齐方检验进行统计分析。乙醇处理和DHT处理的样品在核小体耗竭方面存在显著差异TMPRSS2型b位增强器(P（P）=0.004）和KLK2号位置a处的增强器(P（P）=0.016）。未观察到统计上的显著差异KLK2号DHT治疗2小时后增强剂。（C和E）用DHT处理0.5小时（C）和2小时（D）后LNCaP细胞中无法到达的GpC位点的百分比。显示了每100 bp无法访问的GpC位点的平均百分比。注意，经乙醇处理的对照样品（红色曲线）在所分析的增强子区域显示出可变的可及性范围。DHT（绿色曲线）治疗扩大了范围；显示了乙醇和DHT处理样品之间可接近性的百分比增加。
图6。
图6。
核小体在TMPRSS2型在长期雄激素剥夺后，通过NOMe-Seq分析确定增强子。LNCaP细胞在CSS中培养7天，然后用乙醇（对照）或DHT（10 nM）处理4小时TMPRSS2型增强剂。增强子图显示了GpC位点密度和增强子（绿色条）在所分析区域的位置。乙醇处理的对照组中存在显示M.CviPI可进入区域的DNA模块（茶色泡泡，上面板），并且在DHT处理后，更多的DNA模块显示可进入性增加（茶色气泡，下面板）。每隔100 bp选择7个GpC位点，并在增强子图中用箭头（a到g）表示，使用齐方检验进行统计分析。乙醇和DHT处理的样品在核小体耗竭方面存在显著差异TMPRSS2型位置d处的增强器(P（P）= 0.047). （B） DHT治疗4小时后无法进入GpC部位的百分比。显示了每100 bp无法访问的GpC位点的平均百分比。注意，乙醇处理的对照样品（红色曲线）在长期雄激素剥夺后也显示出可接近性。用10 nM DHT（绿色曲线）治疗扩大了范围；乙醇和DHT处理的样品之间的可接近性增加百分比很明显。增强器相对于可访问区域的位置在图形下方显示为绿色条。还显示了ChIP-qPCR分析中使用的引物集（P1至P5，图2）的位置。请注意，可及性峰值与ChIP-qPCR分析绘制的AR结合区域重叠。
图7。
图7。
核小体占有率的NOMe-Seq分析TMPRSS2型和KLK2号LAPC4和IMR90细胞中的增强子。增强子地图显示了GpC位点密度和增强子（绿色条）在所分析区域的位置。（A） LAPC4细胞在CSS中保存2天，并用乙醇（对照）或DHT处理4小时。DNA模块显示，乙醇处理的对照组中存在M.CviPI可进入区域（茶色气泡，上面板）KLK2号和TMPRSS2型LAPC4细胞中的增强子（上面板）。与LNCaP细胞类似，用DHT处理4小时后，两种增强子对甲基化酶的DNA可及性均增加（茶色气泡，底部面板）。四个(TMPRSS2型)或五个(KLK2号)每100 bp选择一个GpC位点，并在增强子图上用箭头（a到d，a到e）表示，然后使用χ2检验进行统计分析。乙醇和DHT处理的样品在核小体耗竭方面存在显著差异TMPRSS2型位置b处的增强器(P（P）=0.03）和c(P（P）= 0.0115); 治疗组之间没有发现显著差异KLK2号增强剂。（B） DHT处理4小时后无法访问的GpC位点的百分比。显示了每100 bp无法访问的GpC位点的平均百分比。注意，乙醇处理的对照样品（红色曲线）在长期雄激素剥夺后也显示出可接近性。用10 nM DHT（绿色曲线）治疗扩大了范围；显示了乙醇和DHT处理样品之间可接近性的百分比增加。增强器相对于可访问区域的位置在图形下方显示为绿色条。（C） qPCR分析TMPRSS2型和KLK2号用10nM DHT处理LAPC4细胞4小时后的mRNA水平。表达相对于GAPDH水平（RQ，n个= 2). （D） IMR90细胞，不表达TMPRSS2型或KLK2号，显示两种增强子均无法进入M.CviPI。相反，正如预期的那样，表达基因的启动子区域热休克蛋白5/GRP78级（70-kDa热休克蛋白5/78-kDa-葡萄糖调节蛋白）很容易被M.CviPI（茶色泡泡）获得。
图8。
图8。
GATA-2入住率TMPRSS2型,KLK2号、和KLK3号机组GATA-2敲除后LNCaP细胞中的增强子和核小体定位。（A） 乙醇处理的对照细胞（红色实心条）和DHT处理的细胞（绿色实心条）中的所有三个增强子均检测到GATA-2占用，与相应的非抗体对照细胞（红绿色开条）相比，免疫沉淀DNA的富集显示了这一点。GATA-2的特定位点ChIP（见图2）表示为两个独立实验的输入±SEM的平均百分比，在每种情况下，用qPCR分析两个或三个样本。用抗GATA-2或非靶向siRNA的siRNA转染LNCaP细胞（对照）；细胞在CSS中保存2天，用乙醇处理4小时（B）qPCR（上面板）和Western blot（下面板）分析《服务贸易总协定》-2mRNA和蛋白质水平《服务贸易总协定》-2击倒。将模拟转染细胞和转染非靶向（Ntg）siRNA的细胞作为对照。表达相对于GAPDH水平（RQ，n个= 2). 显示了一个具有代表性的斑点。组蛋白H3用作负荷对照。（C） 增强子图显示GpC位点密度和增强子（绿色条）在所分析区域的位置。在所有增强子的非靶向对照中都存在显示M.CviPI可进入区域（茶色气泡）的DNA模块。请注意《服务贸易总协定》-2击倒只在TMPRSS2型增强剂。对TMPRSS2型四个GpC位点的增强子，每100 bp选择一个，并在增强子图上用箭头（a到d）表示。非靶向对照组和对照组之间核小体耗竭的显著差异《服务贸易总协定》-2发现经siRNA处理的样品用于TMPRSS2型增强子（a和b，P（P）< 0.05). （D） 之后无法访问的GpC站点的百分比《服务贸易总协定》-2击倒。显示了每100 bp无法访问的GpC位点的平均百分比。请注意，对于TMPRSS2型增强剂。
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