Exploiting cancer cell vulnerabilities to develop a combination therapy for ras-driven tumors

doi:10.1016/j.ccr.2011.08.014

.2011年9月13日；20(3):400-13.

doi:10.1016/j.ccr.2011.08.014。

利用癌细胞脆弱性开发ras驱动肿瘤的联合治疗

托马斯·德·雷德¹, 赞德拉·沃尔顿, 杰西卡·L·叶斯, 李达南, 陈一美, 克莱尔·马龙, 奥菲莉亚·梅尔滕斯, Seung Min Jeong先生, 罗德里克·布朗森, 瓦莱丽·勒布卢, 拉胡·卡卢里, 艾曼纽尔·诺曼特, 马西娅·海吉斯, 布伦丹·D·曼宁, 王国健, 凯·F·麦克劳德, 凯伦·齐卓斯基

附属公司

PMID： 21907929
预防性维修识别码： PMC3233475型
内政部： 2016年10月10日/j.ccr.2011.08.014

利用癌细胞脆弱性开发ras驱动肿瘤的联合治疗

托马斯·德·雷德等。癌细胞. 2011.

.2011年9月13日；20(3):400-13.

doi:10.1016/j.ccr.2011.08.014。

作者

附属

¹美国马萨诸塞州波士顿市百翰女子医院医学部遗传科，邮编02115。

PMID： 21907929
预防性维修识别码： PMC3233475型
内政部： 2016年10月10日/j.ccr.2011.08.014

摘要

Ras-driven肿瘤通常对常规治疗无效。在这里，我们为两种Ras驱动的癌症确定了一种有希望的靶向治疗策略：Nf1缺陷型恶性肿瘤和Kras/p53突变型肺癌。我们发现，增强蛋白毒性应激的药物，包括HSP90抑制剂IPI-504，在攻击性小鼠模型中诱导肿瘤退化，但仅当与雷帕霉素联合使用时。这些药物通过促进无法解决的内质网应激而协同作用，导致内质网和线粒体的灾难性损伤。这一过程由氧化应激（由IPI-504依赖性产生活性氧物种引起）和雷帕霉素依赖性抑制谷胱甘肽（一种重要的内源性抗氧化剂）引起。值得注意的是，这些药物合作的机制揭示了一种治疗范式，可以扩展到开发其他组合。

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数字

**图1。雷帕霉素和内质网应激诱导剂对MPNST的治疗作用**
**（A）**来源于*Nf1/p53型*突变小鼠MPNST和正常外周神经（NN）。BIP、磷酸化-EIF2a（pEIF2α）和XBP-1的剪接形式（sXBP-1）表明UPR激活。**（B）**在100nM thapsigargin（TG）或0.5ug/ml衣霉素（TN）作用4小时后，MPNST细胞中pEIF2α和sXBP-1的免疫印迹。Actin是一个加载控件。**（C）**正常细胞（IMR90）、人MPNST细胞系（S462，SNF96.2）和小鼠MPNST淋巴细胞系（185-3，1A50）对TG或TN（48小时）的反应LD50值。**（D）**生长曲线比较了不同剂量的thapsigargin和突尼斯霉素对S462人MPNST和IMR90的影响。**（E）**瀑布图，描绘了使用载剂（蓝色）、thapsigargin（红色）、雷帕霉素（黄色）和雷帕霉素/thapsigarkin（绿色）治疗10天后的肿瘤生长情况。左y轴表示肿瘤折叠生长与第0天的对数2，右y轴表示折叠体积的变化。该表显示了每个治疗组（n=8）的平均值和标准偏差以及平均肿瘤收缩率。**（F）**描述肿瘤大小随时间变化的图表。图中显示了雷帕霉素/他司加金三只动物的组合（绿色）。为了简单起见，黄线是雷帕霉素治疗肿瘤的平均体积（n=8）。蓝线和红线分别代表溶媒和thapsigargin治疗的动物。**（G）**用雷帕霉素/他psigargin治疗的动物的H&E染色肿瘤残留物。（a）治疗107天，（b）治疗35天，（c）治疗21天，（d）治疗4天后，肿瘤切片显示整个肿瘤的核固缩。除（d）放大至40倍外，所有图像均采用10倍物镜拍摄。（另见图S1）

**图2。雷帕霉素和IPI-504促进MPNST回归**
**（A）**用IPI-504治疗的人MPNST中BIP、pEIF2α、sXBP-1、IRE1α和PERK随时间（小时）的免疫印迹。注意，pEIF2α、sXBP1、IRE1和PERK的激活（*表示活化的磷酸化PERK）和BIP的初始上调发生在2-4小时内。第二波BIP上调发生在8-16小时之间，因为pEIF2α、sXBP-1、IRE1α和PERK受到抑制。Actin用作加载控件。**（B）**正常细胞（IMR90）、人MPNST细胞系（S462，SNF96.2）和小鼠MPNST电池系（185-3，1A50）对IPI-504（72小时）的反应LD50值。**（C）**不同浓度IPI-504处理的S462细胞株的生长曲线。**（D）**瀑布图描绘了使用载体（蓝色）、IPI-504（红色）、雷帕霉素（黄色）和雷帕霉素/IPI-504（绿色）治疗10天后的肿瘤生长。左y轴表示肿瘤折叠生长与第0天的对数2，右y轴表示折叠体积的变化。该表报告了每个治疗组（n=8）的平均值和标准偏差以及平均肿瘤收缩率。Shapiro-Wilk检验表明，所有数据集都具有正态分布。**（E）**MPNST的照片显示在第0天和使用雷帕霉素/IPI-504治疗10天后。**（F）**雷帕霉素/IPI-504治疗动物的H&E染色肿瘤。**（G）**Hsp70和磷酸化S6免疫印迹显示治疗16小时后肺组织的药效学分析。p120用作加载控制。**（H）**肿瘤治疗16小时的TUNEL染色。**（一）**肿瘤负荷的Kaplain-Meier曲线*Nf1/p53型*如前所述，用载体（黑色）或雷帕霉素（蓝色）治疗突变小鼠。X表示由于皮肤溃疡而被安乐死的动物。所有误差条均显示+/-SD。（另请参见图S2）

**图3。IPI-504诱导的细胞死亡是由于HSP90的抑制以及随后对UPR和ER应激的影响**
**（A）**用两种不同的HSP90抑制剂（500nM IPI-504和500nM BEP800）处理的MPNST细胞系S462的生长曲线。**（B）**用HSP90抑制剂AUY-922（100nM）处理S462细胞72小时。左y轴表示肿瘤折叠变化与第0天的对数2，右y轴表示细胞数量与第0天相比较的相对变化。**（C）**免疫印迹显示AUY-922对人类MPNST细胞BIP、pEIF2α、sXBP-1、IRE1α和PERK随时间（小时）的影响。Actin用作加载控件。**（D）**在1μM IPI-504存在和不存在sXBP1（XBP1的激活剪接形式）过度表达的情况下，细胞死亡的相对水平。右侧面板确认sXBP1的表达。**（E）**在IRE1α和/或PERK被siRNA击倒的细胞中，低剂量IPI-504对生长曲线的反应。免疫印迹证实击倒。**（F）**用100nM IPI-504处理S462细胞72小时，有或没有雷帕霉素预处理（100nM）（左）或猛禽shRNA（右）。左y轴表示肿瘤折叠变化与第0天的对数2，右y轴表示细胞数量与第0天相比较的相对变化。**（G）**与雷帕霉素加IPI-504（300nM）相比，IRE1α和PERK联合敲除（含或不含雷帕霉素）后S462细胞的相对数量。**（F）**在暴露于载体（Veh）、IPI-504（IP）、雷帕霉素（R）和雷帕霉素/IPI-504（RIP）的小鼠中治疗16小时的动物肿瘤组织的pAKT/AKT免疫球。所有错误条显示+/-SD。（另请参见图S3）

**图4。IPI-504和雷帕霉素引起MPNST内质网和线粒体的灾难性破坏**
**（A）**载体、IPI-504、雷帕霉素或雷帕霉素/IPI-504治疗7小时后肿瘤的透射电镜（TEM）图像（5900×1.4×）。**（B）**用雷帕霉素/IPI-504治疗7小时的肿瘤的TEM图像（15000×1.4×）。黑色箭头表示带有货物的双层自噬体。**（C）**用雷帕霉素/IPI-504治疗7小时的肿瘤的TEM图像。黑色箭头显示自噬体从线粒体（左侧）和ER（右侧）发出。**（D）**（顶部）用载体（V）、IPI-504（I）、雷帕霉素（R）或雷帕霉素和IPI-505（RIP）处理的动物MPNST组织p62（SQSTM1）的免疫印迹。（下图）第二个免疫印迹显示RIP治疗的其他肿瘤中p62水平降低。**（E）**用mCherry-EGFP-LC3B感染S462细胞，并用100nM雷帕霉素和4μM IPI-504处理2和8小时。黄色/绿色斑点代表自噬体。红色斑点代表自噬体。**（F）**条形图表示雷帕霉素和IPI-504治疗0、2和8小时后自噬体（黄色条）和自噬溶酶体（红色条）的平均数量。**（G）**说明内质网应激、线粒体和活性氧生成之间相互作用的模型。**（H）**描述暴露于载体、IPI-504、雷帕霉素或雷帕霉素/IPI-504的肿瘤中ER的相对大小的TEM。**（一）**TEM显示，雷帕霉素治疗的肿瘤（蓝色圆点）中存在大量内质网膜，而与雷帕霉素/IPI-504暴露16小时的肿瘤相比，这些肿瘤不可见。黑色箭头显示，雷帕霉素治疗的肿瘤中有一些自噬体，而雷帕霉素/IPI-504治疗的肿瘤则有许多。**（J）**TEM显示载体治疗肿瘤中的正常线粒体（蓝色箭头，左）与雷帕霉素/IPI-504治疗肿瘤中肿胀的囊泡化线粒体16小时（蓝色箭头（右））。图中左侧的线粒体被自噬体吞噬。（另请参见图S4）

**图5。氧化应激在调节IPI-504和雷帕霉素的治疗反应中起着关键作用**
**（A）**IPI-504诱导MPNST细胞活性氧水平的变化*在体外*。红线表示荧光强度的变化，反映活性氧的产生。**（B）**500nM IPI-504+/-100uM维生素C存在下的细胞死亡相对水平。**（C）**瀑布图描绘了雷帕霉素/IPI-504治疗10天后的肿瘤生长，如图2（绿色）与雷帕霉素/IPI-504和维生素C（黑色）所示。左y轴表示肿瘤折叠生长与第0天的对数。**（D）**500nM BEP800+/-100uM维生素C引起的细胞死亡相对水平。**（E）**（前4个面板）使用PML抗体（绿色）对治疗7小时的肿瘤进行免疫细胞化学。（底部2个面板）冷冻MPNST肿瘤组织的二氢乙硫啶染色（红色）显示在治疗7小时后，ROS水平随着Rap/IPI-504的反应而增加。**（F）**IPI-504/Rap诱导S462细胞活性氧的动力学。**（G）**S462细胞对IPI-504/Rap的反应中ADP/ATP比率的动力学。请注意，ROS的产生先于ADP/ATP水平的增加（ATP的减少）。**（H）**如图所示，治疗7小时的动物肿瘤中的SREBP1 mRNA水平。**（一）**免疫印迹显示FASN、ACC和G6PD在治疗7h的动物肿瘤中的表达。肌动蛋白作为负载控制。**（J）**按照i。**（K）**用载体或雷帕霉素/IPI-504治疗的肿瘤中还原型谷胱甘肽（GSH）的相对水平（n-6）。**（左）**在体外表达G6PD或GFP控制质粒的细胞中，IPI-504引起的细胞死亡的相对水平。免疫印迹显示左侧面板中使用的MPNST中的G6PD蛋白水平。（另请参见图S5）

**图6。Rapamcyin/IPI-504促进*喀斯特^G12D系列，p53*-非小细胞肺癌**
**（A）**规定的动物治疗前后的MRI图像。红色圆圈突出肿瘤肿块。**（B）**表列出了MRI测定的单个肿瘤肿块的体积变化。**（C）**瀑布图描述了使用雷帕霉素和IPI-504治疗的单个动物肿瘤总体积的减少。**（D）**治疗14天后肺组织切片的H&E染色（2×）。**（E）**使用载体、雷帕霉素、IPI-504或雷帕霉素/IPI-504治疗2周的动物皮损的H&E染色。图像b、d和f分别是图像a、c和e的放大。（另请参见图S6）

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中的注释

Ras、ROS和蛋白毒性应激：微妙的平衡。
Xu W，Trepel J，Neckers L。徐伟等。癌细胞。2011年9月13日；20(3):281-2. doi:10.1016/j.ccr.2011.08.020。癌细胞。2011 PMID：21907917 免费PMC文章。

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1. 马萨诸塞州贝尔西。狂热症的流行病学。公牛世界卫生组织。1973;48:1–13.-项目管理咨询公司-公共医学
1. Cawthon RM、Weiss R、Xu GF、Viskochil D、Culver M、Stevens J、Robertson M、Dunn D、Gesteland R、O'Connell P等。神经纤维瘤病1型基因的主要片段：cDNA序列、基因组结构和点突变。单元格。1990;62:193–201.-公共医学
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