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。2011年11月；119(4):868-78.
doi:10.1111/j.1471-4159.2011.07470.x。 Epub 2011年10月3日。

Smad蛋白差异调节转化生长因子-β介导的硫酸软骨素蛋白多糖诱导

巴拉·T·S·苏萨拉 1, 埃里克·德莱恩, 潘潘玉, 片垣靖弘, 赫伯特·M·盖勒, Aviva J Symes公司
附属公司

Smad蛋白差异调节转化生长因子-β介导的硫酸软骨素蛋白多糖诱导

巴拉·T·S·苏萨拉等。 神经化学杂志。 2011年11月。

摘要

中枢神经系统的创伤导致硫酸软骨素蛋白多糖（CSPG）的表达和沉积增加，而硫酸软骨素蛋白多糖对轴突再生具有抑制作用。转化生长因子-β（TGF-β）被认为是这些变化的主要介质，但TGF-α调节CSPG表达的机制尚不清楚。利用慢病毒表达的Smad特异性ShRNA，我们表明TGF-β诱导星形胶质细胞CSPG表达是Smad依赖性的。然而，我们发现合成机械对Smad2和/或Smad3的差异依赖性。神经能和木糖基转移酶1的TGF-β诱导需要Smad2和Smad3，而磷酸和软骨素合成酶1的诱导需要Smad2而不是Smad3。Smad3敲除选择性地降低了软骨素-4-硫转移酶1的诱导和星形胶质细胞分泌的4-硫酸化CSPG的数量。此外，星形胶质细胞中Smad3的敲除在促进TGF-β处理的星形胶质细胞上培养的神经元突起生长方面更有效。我们的数据表明TGF-βSmad3介导的4-硫酸化诱导是星形胶质细胞分泌CSPG允许轴突生长的关键决定因素。

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数字

图1
图1
表达Smad2或Smad3的ShRNA的慢病毒特异性地抑制C8D1A细胞中Smad的表达。慢病毒感染C8D1A细胞4天后，对细胞进行裂解并分析Smad表达。典型的western blot显示（a）特异性Smad2敲除和（b）Smad3敲除在慢病毒感染Smad特异性shRNA后。Smad免疫反应的量化（c&d）归一化为肌动蛋白（平均值±SEM，n=3）。（*p<0.05:t检验）。
图2
图2
Smad2或Smad3对TFG-β介导的CSPG核心蛋白增加的差异作用。在存在或不存在LV-ShSmad2或LVShSmad3的情况下，用TGF-β（10 ng/ml）处理3天的星形胶质细胞，通过QPCR定量神经干细胞（a）、磷酸根（d）和短肽（g）mRNA的表达。mRNA表达归一化为亲环素，并以TGF-β处理/未处理样品的表达百分比表示（平均值±标准偏差，n=3-5个独立实验），并与LV对照组进行比较。典型的Western blot显示神经干细胞（b）、磷酸根（e）和短链淀粉聚糖（h）在chABC处理的条件培养基中的表达，这些条件培养基取自在LV-ShSmad2或LVShSmad3存在下用TGF-β处理3天的星形胶质细胞。使用LAS3000成像系统（富士胶片）量化免疫反应性。（c） 通过western blot定量神经干细胞（c）、磷酸根（f）和短肽（i）的表达（平均值±标准差，n=3-7）。数据以TGF-β治疗组与未治疗组样本的表达百分比表示，并与LV对照组进行比较。（*p<0.05**p<0.01，***p<0.001；bonferroni检验后的方差分析）。
图3
图3
（a） CSPG糖胺聚糖链合成示意图。（b） TGF-β治疗对XT-1、XT-2、CSGalNacT-1、ChSy-1、C4ST-1和C6ST-1 mRNA表达的影响。TGF-β（10 ng/ml）处理三天后，从星形胶质细胞制备RNA，并进行定量RT-PCR，mRNA表达归一化为亲环素或GAPDH，并以TGF-。（**p<0.01；***p<0.001；t检验）。
图4
图4
Smad特异性敲除对TGF-β诱导的XT-1、ChSy-1和C4ST-1表达增加的影响。在存在或不存在LV-ShSmad2或LVShSmad3的情况下，用TGF-β（10 ng/ml）处理3天的星形胶质细胞，通过QPCR定量XT-1（a）、ChSy-1（b）和C4ST-1（c）mRNA的表达。mRNA表达归一化为亲环素，并表示为TGF-β处理与未处理样品的表达百分比（平均值±标准偏差，n=3-5个独立实验）。（*p<0.05**p<0.01；bonferroni后检验的方差分析）。
图5
图5
Smad特异性敲除减轻TGF-β介导的神经突起生长抑制。星形胶质细胞感染（a；b）LV-Sh对照（c）LV-ShSmad2；或（d）LV-ShSmad3三天，然后用（b，c，d）TGF-β（10ng/ml）再治疗三天。改变培养基，小脑颗粒神经元被镀到星形胶质细胞单层上。20小时后，固定细胞，免疫组化观察神经元并测量其相对轴突长度。比例尺；50微米。（e） Smad敲除对轴突生长的影响图（三个独立实验的平均值±标准差）。将每种情况下的相对轴突长度与未经治疗的LV-Sh对照组进行比较。敲除特定Smad蛋白可显著减轻TGF-β介导的轴突生长抑制（*p<0.05；***p<0.001；bonferroni后测ANOVA）。
图6
图6
Smad3敲除抑制TGF-β诱导的星形胶质细胞4-硫酸化的量。典型的western blot显示，在条件培养基中2H6（a）、CS56（b）的表达，条件培养基取自经TGF-β（10ng/ml）处理3天、LV-ShSmad2或LV-ShSmad3存在的星形胶质细胞。（b）2H6和（d）CS56免疫反应性的西部定量（平均值±标准偏差，n=3-4）。数据以TGF-β处理后与未处理样品的表达百分比表示，并与LV-Sh对照组进行比较。（*p<0.05；bonferroni后测方差分析）。
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