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.2011年11月1日；71(21):6836-47.
doi:10.1158/0008-5472.CAN-11-0846。 Epub 2011年9月2日。

NOTCH3介导的鳞状细胞分化程序限制表达ZEB转录因子的EMT-活性细胞的扩增

Shinya Ohashi先生 1, Mitsuteru Natsuizaka公司, 永沼诚二, Shingo Kagawa公司, 索泰·基穆拉, 伊藤浩史, 罗斯·A·卡尔曼, 中川茂, 道格拉斯·S·达林, Devraj巴苏, 菲利斯·吉莫蒂, 安德烈·克莱恩·桑托, J阿兰·迪尔, 米恩哈德·赫林, 中川裕志
附属公司

NOTCH3介导的鳞状细胞分化程序限制表达ZEB转录因子的EMT-活性细胞的扩增

Shinya Ohashi先生等。 癌症研究. .

摘要

锌指E-box-binding（ZEB）蛋白ZEB1和ZEB2是TGF-β介导的衰老、上皮-间充质转化（EMT）和肿瘤干细胞功能中必不可少的转录因子。ZEB由miR-200 microRNA家族成员负调控，但表达ZEB的肿瘤细胞在侵袭性生长过程中是如何出现的尚不清楚。在这里，我们报道了NOTCH3介导的信号传导阻止了ZEB表达细胞的独特亚群的扩增。ZEB的表达与人食管细胞缺乏进行NOTCH3介导的鳞状分化的细胞能力有关。显性负性Mastermind-like 1（DNMAML1）对Notch介导的转录活性的遗传抑制阻止了包括NOTCH3在内的Notch靶基因的鳞状分化和诱导。此外，富含DNMAML1的EMT-活性细胞在裸鼠中表现出强烈的ZEB上调、miR-200家族下调，并增强了凤尾鱼非依赖性生长和肿瘤形成。RNA干扰实验表明，ZEB参与了凤尾鱼非依赖性菌落的形成、入侵和TGF-β介导的EMT。DNMAML1在人体组织工程的一种形式的器官型三维培养中对Notch的抑制作用使侵袭性生长和受损的鳞状细胞分化得以重现。总之，我们的发现表明，NOTCH3是限制ZEB表达细胞扩张的关键因素，为Notch信号在食管鳞癌细胞命运调节和疾病进展中的作用提供了新的机制性见解。

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数字

图1
图1。ESCC侵袭前沿ZEB1上调
两例原发性食管鳞癌患者的H&E代表性图像和ZEB1的相应IHC代表性图像，表现为低分化浸润性肿瘤巢（A）和围绕高分化病变的肿瘤细胞，形成角蛋白珍珠（B）。所选区域在相应的下部面板中被放大。注意，ZEB1阳性肿瘤细胞倾向于显示纺锤体细胞分化（箭头所示）。基质炎症细胞和成纤维细胞（箭头）对ZEB1也呈阳性。比例尺，100μm。
图2
图2。表达EMT标记物的ESCC细胞中ZEB的上调和与Notch活性丧失相关的鳞状细胞分化受损
在（A）中对指示细胞株进行实时RT-PCR，在（B）中进行Western blotting。用0.6 mM Ca处理EPC2-hTERT细胞2+（EPC2-Ca高)72小时诱导Notch依赖性终末分化或不治疗（EPC2-Ca低).答：。测定指示基因的相对mRNA水平。β-actin起到了内部控制作用。CDH1型，E-钙粘蛋白；CDH2公司，N-钙粘蛋白；N1型，缺口1；N3号机组，槽口3；#，P（P）与EPC2-Ca相比<0.01低; *,P（P）与EPC2-Ca相比<0.01高（n=3）。B。使用核提取物来确定Notch的激活状态。组蛋白H1作为负载对照。ICN1和ICN3分别代表NOTCH1和NOTCH3的活性形式。
图3
图3。DNMAML1抑制Notch信号传导抑制食管细胞鳞状分化并增强EMT和恶性潜能
在器官型3D培养（A）、软琼脂集落形成试验（B）和异种移植模型（C）中比较表达DNMAML1或GFP的EPC2-T细胞。答：。在器官型3D培养中重建分层鳞状上皮。对石蜡包埋终产物的连续切片进行形态学分析。注意，DNMAML1显著抑制上皮厚度并刺激细胞侵入基质。IVL和E-cadherin在表达DNMAML1的CK14阳性侵袭细胞中丢失或定位错误，请注意，GFP控制细胞形成的角蛋白珍珠样浸润细胞巢在细胞膜上表达IVL和E-cad，因此与鳞状细胞分化一致。蓝色，DAPI；上皮；Str，基质；比例尺，50μm。B。细胞在软琼脂中培养2周并进行显微照相。在光学显微镜下按低倍视野测定菌落数量和大小。*，P（P）<0.01 vs.GFP，n=6。C、。裸鼠肿瘤生长通过以下方法监测8周体内td番茄红荧光蛋白成像。直方图表示肿瘤大小。*，P（P）<0.01 vs.GFP，n=3。
图4
图4。DNMAML1在转化人食管细胞中诱导ZEBs
在有或无DNMAML1的EPC2-T细胞中测定ZEB的表达。答：。在器官型3D培养的细胞中对ZEB1进行IHC。所选区域在相应的下部面板中被放大。值得注意的是，在GFP对照细胞和DNMAML1细胞的上皮细胞室中均观察到轻核染色，这在癌症中偶尔观察到就地，但不是正常的人类食管粘膜（补充图S1）。然而，在DNMAML1存在的情况下，检测到更强烈的核ZEB1（箭头）。基质成纤维细胞（箭头）对ZEB1也呈阳性反应。比例尺，100μm。B。定量实时RT-PCR测定ZEB1和ZEB2的相对mRNA水平。β-actin起到了内部控制作用，P（P）<0.01 vs.GFP（n=3）。C、。Western blotting检测核提取物中的ZEB1和ZEB2。组蛋白H1用作负荷控制。D。流式细胞术检测ZEB1阳性细胞，如分段线所示，并以直方图表示(P（P）<0.01 vs.GFP，n=3）。
图5
图5。ZEBs在表达DNMAML1的转化人食管细胞中介导EMT
在（A）-（E）中用TGF-β1刺激表达DNMAML1或GFP（对照）的EPC2-T细胞2周。在（C）-（E）中，对表达针对ZEB1、ZEB2或非沉默控制序列（Scramblee）的四环素诱导（Tet-On）shRNA的细胞进行TGF-β1刺激，加或不加1μg/ml强力霉素（DOX），持续2周。使用两个独立的shRNA序列显示了具有代表性的数据和可比较的结果。A和C如直方图所示，采用相控图像对纺锤形细胞（箭头）进行评分。比例尺，50μm。在A中，*，P（P）<0.01 vs.GFP加TGF-β1（+）；#，P（P）<0.05 vs.GFP加TGF-β1（−）(n个= 6). 在C中，*，P（P）<0.01 vs.仅TGF-β1(n个= 6).B和EWestern blotting测定了以β-肌动蛋白为负荷控制的指示分子。D。实时RT-PCR测定以β-肌动蛋白作为内部对照的指示基因的mRNA。CDH1型，E-钙粘蛋白；CDH2公司，N-钙粘蛋白；*，P（P）<0.01 vs.仅TGF-β1（n=3）。
图6
图6。Notch3敲除通过上调ZEB促进EMT并损害人类食管细胞的鳞状分化机制
分析表达针对NOTCH3（NOTCH3-A和NOTCH3-B）或非沉默控制序列（Scramble）的两个独立shRNA序列的EPC2-hTERT衍生物，以验证微阵列数据。答：。实时RT-PCR测定以β-肌动蛋白作为内部对照的指示基因的mRNA。CDH1型，E-钙粘蛋白；CDH2型，N-钙粘蛋白；*，P（P）<0.01 vs.加扰（n=3）。B。采用相位对照图像对纺锤形细胞（箭头）进行评分，如直方图所示，P（P）<0.01 vs.加扰（n=6）。比例尺，50μm。使用Notch3-A和Notch3-B显示了具有代表性的数据（Notch3-A）和可比较的结果。
图7
图7。模型
Notch信号调节正常食管上皮的鳞状分化。在分化良好的肿瘤巢中，Notch信号也有助于角蛋白珍珠的形成。ZEB1在肿瘤细胞没有鳞状分化的侵袭前沿表达。早期病变，如癌就地ZEB可能是对癌基因激活（例如EGFR）的响应而诱导的，以作为细胞失效安全机制来抵消癌基因诱导的衰老（23）。在晚期ESCC中，NOTCH3可能下调，导致脱分化状态，其中微环境线索（如TGF-β和缺氧）可能与ZEB协同促进EMT，导致侵袭性生长和肿瘤细胞扩散。在本研究中，针对NOTCH3（N3）的DNMAML1或shRNA被用于抑制典型的Notch介导的鳞状细胞分化，以促进ZEB介导的EMT。
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