Ebola virus entry requires the cholesterol transporter Niemann-Pick C1

doi:10.1038/nature10348

.2011年8月24日；477（7364）：340-3。

doi:10.1038/nature10348。

埃博拉病毒进入需要胆固醇转运蛋白Niemann-Pick C1

Jan E光标¹, 马蒂杰斯·拉本, 安东尼·C·王, 安德鲁·赫伯特, 格雷戈·奥伯诺斯特勒, Nirupama Mulherkar公司, 安娜·I·奎恩, 菲利普·克兰祖什, 4月M日格里芬, 戈登·鲁瑟尔, 保拉·达尔辛, 约翰·戴伊, 肖恩·普·惠兰, 卡蒂克·钱德兰, Thijn R Brummelkamp公司

附属公司

PMID： 21866103
预防性维修识别码： PMC3175325型
内政部： 10.1038/自然10348

埃博拉病毒进入需要胆固醇转运蛋白Niemann-Pick C1

Jan E光标等。自然. 2011.

.2011年8月24日；477(7364):340-3.

doi:10.1038/nature10348。

作者

Jan E光标¹, 马蒂杰斯·拉本, 安东尼·C·王, 安德鲁·赫伯特, 格雷戈·奥伯诺斯特勒, Nirupama Mulherkar公司, 安娜·I·奎恩, Philip J Kranzusch公司, 4月M日格里芬, 戈登·鲁塞尔, 中国保拉达尔, 约翰·戴伊, 肖恩·普·惠兰, 卡蒂克·钱德兰, Thijn R Brummelkamp公司

附属

¹美国马萨诸塞州剑桥市九剑桥中心怀特海生物医学研究所，邮编：02142。

PMID： 21866103
预防性维修识别码： PMC3175325型
内政部： 10.1038/自然10348

摘要

埃博拉和马尔堡丝状病毒的感染会在人类中引起一种快速致命的出血热，目前尚无批准的抗病毒药物。丝状病毒进入由病毒棘突糖蛋白（GP）介导，该糖蛋白将病毒颗粒附着到细胞表面，将其传递到内体，并催化病毒和内体膜之间的融合。病毒膜融合可能需要内体室中的其他宿主因子；然而，尽管付出了相当大的努力，这些关键的宿主因子仍然难以进行分子鉴定。在这里，我们描述了人类细胞全基因组单倍体基因筛查，以确定埃博拉病毒进入所需的宿主因子。我们的筛查发现67个突变破坏了同型融合和空泡蛋白转运（HOPS）多亚单位系链复合体的所有六个成员，该复合体参与内切体与溶酶体的融合，39个独立突变破坏了内切体/溶酶体胆固醇转运蛋白Niemann-Pick C1（NPC1）。HOPS复合物或NPC1功能缺陷的细胞，包括来自人类尼曼-匹克C1型疾病患者的原代成纤维细胞，对埃博拉病毒和马尔堡病毒的感染具有抵抗力，但仍然对一系列无关病毒完全敏感。我们表明，丝状病毒糖蛋白介导的膜融合和病毒从囊泡室逃逸需要NPC1蛋白，这与其已知的胆固醇转运功能无关。我们的发现揭示了丝状病毒进入途径的独特特征，并指出了对抗这些致命毒剂的潜在抗病毒策略。

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利益冲突声明

竞争性金融利益

J.E.C.、M.R.、S.P.W.、K.C.和T.R.B.已就本研究中确定的丝状病毒宿主因子申请了专利，T.R.B.是Haplogen公司的联合创始人，Haplogen-一家从事单倍体遗传方法的早期公司。

数字

**图1。单倍体基因筛查确定HOPS复合物和NPC1是丝状病毒进入的宿主因子**
**a、，**与未选择的对照细胞相比，在rVSV-GP-EboV选择的细胞群中富集用于基因陷阱插入的基因。圆圈代表基因，其大小对应于rVSV-GP-EboV选定群体中确定的独立插入数。基因根据染色体位置在X轴上排列。**b、，**RT-PCR分析突变克隆中NPC1、VPS33A和VPS11的表达水平。**c、，**VSV伪型与指定丝状病毒糖蛋白的感染性。显示平均值±标准偏差（SD）（n=3）。埃博病毒、埃博拉病毒（扎伊尔）、马尔病毒、马尔堡病毒*低于检测极限。**日期：，**HAP1克隆感染病毒，包括携带狂犬病或博尔纳病病毒糖蛋白的重组VSV病毒（rVSV-G-RABV和rVSV-GP-BDV），并用结晶紫染色。

**图2。丝状病毒糖蛋白介导的病毒感染需要NPC1而不是NPC2**
**a中，**来自健康个体和携带NPC1或NPC2纯合突变的患者的原代皮肤成纤维细胞用菲利平染色，或用rVSV-G或rVSV-GP EboV攻击。通过荧光显微镜观察到染有菲律宾血迹（黑色）和感染细胞（绿色）。为了清晰起见，将菲律宾染色的图像倒置。蓝色表示赫斯特核染色。**b、，**对照组和Niemann-Pick成纤维细胞中病毒糖蛋白伪型VSV的感染性*低于检测极限。**c、，**表达空载体或人类NPC1的NPC1患者成纤维细胞用filipin染色或用rVSV-GP-EboV激发。**日期：，**用指示浓度的U18666A预培养30分钟后，Vero细胞中rVSV-G和rVSV-GP-EboV的感染性。比例尺，200μm(一，**c（c）**). 显示平均值±SD（n=3至6）(b条，d日).

**图3。埃博拉病毒在缺乏HOPS复合物和NPC1的细胞中进入晚期受阻**
**a、，**病毒颗粒附着并内化为HOPS和NPC1缺陷细胞。指示的HAP1克隆在4°C下感染Alexa 647标记的rVSV-GP-EboV（蓝色）。非内部结合病毒颗粒（蓝色）也用GP特异性抗体（绿色）染色，质膜用Alexa 594-小麦胚芽凝集素（红色）染色(**顶部面板**). 为了评估病毒内部化，将细胞加热至37°C(底板). 内化病毒颗粒（蓝点）对酸剥离具有抵抗力，并且无法获得GP抗体。**b、，**细胞接种rVSV-GP-EboV并通过透射电子显微镜检查。显示了早期进入步骤的典型图像。**c、，**在玻璃体中，rVSV-GP-EboV不能绕过VPS11中观察到的感染阻断^通用技术，VPS33A^通用技术和NPC1^通用技术细胞。所示HAP1克隆中嗜热菌溶血素分离rVSV-GP-EboV的感染性*低于检测极限。d日HOPS复合物和NPC1缺陷细胞阻止病毒逃逸到细胞质。用U18666A（10μg/ml）处理野生型HAP1细胞，将所示突变克隆感染VSV或rVSV-GP-EboV病毒3h，并进行VSV M染色（红色）。标点染色用箭头表示。**e、，**感染rVSV-GP-EboV的VPS33A-和NPC1缺陷HAP1细胞以及NPC1缺陷成纤维细胞的电子显微照片显示，在囊泡室中有子弹状VSV颗粒聚集。所有图像均在接种后3小时拍摄。星号突出显示横截面中的rVSV-GP-EboV粒子。

**图4。感染真正的埃博拉病毒和马尔堡病毒需要NPC1功能**
**a、，**NPC1患者成纤维细胞在0.1倍感染率（MOI）下暴露于埃博氏病毒或巨细胞病毒。采集上清液并测量感染病毒的产量*低于检测极限。**b、，**用DMSO或U18666A（20μM）处理的Vero细胞以0.1的MOI感染EboV或MarV，并测量感染性病毒的产量。**c（c）**人外周血单核细胞衍生树突状细胞（DC）和脐静脉内皮细胞（HUVEC）在存在或不存在U18666A的情况下以3的MOI感染，并通过免疫染色测定感染细胞的百分比。**日期：，**用表达非靶向shRNA（Ctrl）或靶向NPC1的shRNA的慢病毒载体转导HUVEC，在MOI为3时感染EboV或MarV，并测定感染细胞的百分比。细胞的代表性图像也显示：绿色，病毒抗原；蓝色，核染色。对于面板**a–d**，显示平均值±SD（n=2至3）。在面板中**a–b**，错误栏不可见，因为它们位于符号内。对于面板**c–d码**，**p值<0.01，***p值<0.001。**e、，**NPC1的存续^+/+和NPC1^−/+小鼠（每组10只）腹腔接种约1000 pfu小鼠适应的埃博氏病毒或巨细胞病毒。**f、，**针对CatB、HOPS复合体和NPC1在埃博拉病毒进入中的作用提出的假设模型。

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中的注释

埃博拉病毒进入的致命弱点。
弗莱明A。弗莱明A。 Nat Rev药物发现。2011年9月30日；10(10):731. doi:10.1038/nrd3568。 Nat Rev药物发现。2011 PMID：21959282 没有可用的摘要。

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[10] Chandran K、Sullivan NJ、Felbor U、Whelan SP、Cunningham JM。埃博拉病毒糖蛋白的体内蛋白水解对感染是必要的。科学。2005;308:1643–1645. doi:10.1126/science.1110656。1110656【pii】-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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