Haloperidol regulates the state of phosphorylation of ribosomal protein S6 via activation of PKA and phosphorylation of DARPP-32

doi:10.1038/npp.2011.144

比较研究

.2011年11月；36(12):2561-70.

doi:10.1038/npp.2011.144。 Epub 2011年8月3日。

氟哌啶醇通过激活PKA和磷酸化DARPP-32调节核糖体蛋白S6的磷酸化状态

艾曼纽尔·瓦尔詹特¹, 耶稣·伯特伦·冈萨雷斯, 希瑟保龄球, 塞巴斯蒂安·洛佩兹, 伊曼纽拉·桑蒂尼, 米里亚姆·马塔马莱斯, 亚历山德拉·博尼托·奥利瓦, 丹尼斯·埃尔韦, 查尔斯·霍费尔, 埃里克·克伦, Jean-Antoine Girault公司, 吉尔伯托·菲松

附属公司

PMID： 21814187
PMCID公司：项目经理194082
内政部： 10.1038/npp.2011.144

比较研究

氟哌啶醇通过激活PKA和磷酸化DARPP-32调节核糖体蛋白S6的磷酸化状态

艾曼纽尔·瓦尔詹特等。神经精神药理学. 2011年11月.

.2011年11月；36(12):2561-70.

doi:10.1038/npp.2011.144。 Epub 2011年8月3日。

作者

艾曼纽尔·瓦尔詹特¹, 耶稣·伯特伦·冈萨雷斯, 希瑟保龄球, 塞巴斯蒂安·洛佩兹, 伊曼纽拉·桑蒂尼, 米里亚姆·马塔马莱斯, 亚历山德拉·博尼托·奥利瓦, 丹尼斯·埃尔韦, 查尔斯·霍弗, 埃里克·克伦, Jean-Antoine Girault公司, 吉尔伯托·菲松

附属

¹瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所神经科学系。

PMID： 21814187
PMCID公司：项目经理194082
内政部： 10.1038/npp.2011.144

摘要

服用典型的抗精神病药物，如氟哌啶醇，可以促进纹状体中棘神经元（MSN）的cAMP依赖性信号传导。在这项研究中，我们检测了氟哌啶醇对核糖体蛋白S6（rpS6）磷酸化状态的影响，该蛋白是小40S核糖体亚基的一种成分。我们发现氟哌啶醇增加了双位点Ser235/236处rpS6的磷酸化，这参与了mRNA翻译的调节。这种效应在间接途径的MSN中发挥，该途径特异性表达多巴胺D2受体（D2R）和腺苷A2受体（A2AR）。氟哌啶醇的作用通过阻断A2AR或Gα（olf）蛋白的遗传衰减而减弱，后者将A2AR与腺苷酸环化酶的激活偶联。此外，刺激cAMP依赖性蛋白激酶A（PKA）可增加培养纹状体神经元的Ser235/236磷酸化。氟哌啶醇促进rpS6磷酸化的能力在蛋白磷酸酶-1抑制剂、多巴胺和cAMP调节的32 kDa磷酸蛋白缺乏PKA激活的敲除小鼠中被消除。相反，p70 rpS6激酶1或细胞外信号调节激酶的药理学或遗传失活不影响氟哌啶醇诱导的rpS6磷酸化。这些结果确定PKA是神经细胞中主要的rpS6激酶，并表明通过rpS6调节蛋白质合成可能是抗精神病药物的潜在靶点。

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数字

图1
氟哌啶醇对纹状体中层棘神经元核糖体蛋白S6（rpS6）磷酸化的影响。（a）用载体（Veh）或氟哌啶醇（Hal；0.5 mg/kg）治疗并在15或60分钟后死亡的小鼠纹状体中磷酸化-Ser235/236-rpS6（P-235/236-rpS6）的Western blot分析。右侧面板显示了使用抗P-235/236-rp S6（上部）和总rpS6（下部）抗体获得的代表性自射线照片。左侧面板是以平均值±SEM表示的数据摘要(n个=5–7;^*第页<0.05与车辆）。（b）背侧纹状体共焦切片，显示Veh或Hal处理并在15或60分钟后灌注的小鼠中P-Ser235/236-rpS6的免疫荧光。比例尺=40μm。（c和d）小鼠纹状体前脑表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）(*图纸2*-EGFP）或纹状腺素(*图纸1a*-EGFP）MSN用Veh或Hal（0.5 mg/kg）治疗，15或60分钟后灌注。（c） Veh或Hal处理后背侧纹状体EGFP阳性（D2阳性）或EGFP阴性（D2阴性）神经元中P-235/236-rpS6免疫反应神经元的定量*图纸2*-EGFP小鼠(^**第页<0.001与各自的车辆）。（d）用Veh或Hal处理并在15分钟后灌注的小鼠背纹状体的共聚焦切片显示P-235/236-rpS6的免疫荧光与EGFP荧光的结合。比例尺=30μm。（e和f）小鼠纹状体前脑表达EGFP(*图纸2*-用Veh或Hal（0.5 mg/kg，2周内每天注射一次）反复治疗EGFP MSN，并在挑战性注射Veh或Hal后15分钟灌注。（e）背纹状体EGFP阳性（D2阳性）和EGFP阴性（D2阴性）神经元中P-235/236-rpS6免疫反应神经元的定量*图纸2*-长期（2周）用Veh或Hal治疗的EGFP小鼠，并用Veh和Hal激发(^**第页<0.001与车辆；°°第页<0.01与哈尔）。（f）背侧纹状体共焦切片显示P-235/236-rpS6的免疫荧光与EGFP荧光相结合。比例尺=30μm。

图2
阻断哺乳动物雷帕霉素复合物1（mTORC1）/p70 rpS6激酶（S6K）信号转导靶点并不影响氟哌啶醇诱导的核糖体蛋白S6（rpS6）磷酸化。野生型小鼠用溶媒（Veh）、氟哌啶醇（Hal；0.5 mg/kg）或Hal加雷帕霉素（5 mg/kg；每天给药一次，剂量为5 ml/kg体重，从给药前3天开始），并在15或60天后灌注min。（a）用赋形剂（Veh–Veh）、氟哌啶醇（Veh–Hal）或氟哌啶醇加雷帕霉素（雷帕霉素–Hal）处理并在15分钟后灌注的小鼠背纹状体单共焦切片中的磷酸-Ser235/236-rpS6（P-235/236-rpS6）免疫反应性。比例尺=30μm。（b） Veh–Veh、Veh–Hal或Rapamycin–Hal治疗的小鼠背侧纹状体中P-235/236-rpS6免疫反应神经元的定量(^**第页<0.001与Veh–Veh）。（c）用Veh、Hal（0.5 mg/kg）或Hal加雷帕霉素（5 mg/kg；见上文），15分钟后被处死。典型的放射自显影显示，用雷帕霉素治疗的小鼠纹状体中磷酸-Thr389-S6K免疫反应性降低。（d）野生型或S6K1基因敲除（KO）小鼠用载体或氟哌啶醇（0.5 mg/kg）治疗，15分钟后处死。通过蛋白质印迹法测定P-235/236-rpS6的纹状体水平。顶部面板显示了使用抗P-235/236-rpS6（上部）和总rpS6（下部）抗体获得的代表性放射自显影图。底部面板是以平均值±SEM表示的数据摘要(n个=5;^*第页<0.05与各自的车辆）。（e）与野生型小鼠相比，S6K1 KO小鼠纹状体中无S6K免疫反应的典型自射线照片。

图3
丝裂原活化蛋白激酶/ERK激酶（MEK）抑制对氟哌啶醇诱导的核糖体蛋白S6（rpS6）磷酸化的影响。用溶媒（Veh）、氟哌啶醇（Hal；0.5 mg/kg）或Hal加SL327（50 mg/kg；Hal前45分钟给药），15分钟后灌注。（a）用Hal或Hal加SL327治疗的小鼠背侧纹状体单个共焦切片中的磷酸Ser235/236-rpS6（P-235/236-rpS6）免疫反应性。比例尺=30μm。（b） Veh、Hal或Hal加SL327治疗的小鼠背侧纹状体中P-235/236-rpS6免疫反应神经元的定量(^**第页<0.01与车辆）。（c）用Veh、Hal（0.5 mg/kg）或Hal加SL327（50 mg/kg；见上文），并在15分钟后处死。典型的放射自显影图显示使用MEK抑制剂治疗的小鼠纹状体中磷酸-ERK免疫反应性降低。

图4
KW6002对氟哌啶醇诱导的核糖体蛋白S6（rpS6）磷酸化的影响。小鼠接受溶媒（Veh）、氟哌啶醇（Hal）或Hal加KW6002（3 mg/kg；Hal前5分钟给药），15或60分钟后灌注。（a）用Hal或Hal加KW6002治疗的小鼠背侧纹状体单个共焦切片中的磷酸Ser235/236-rpS6（P-235/236-rpS6）免疫反应性。比例尺=30μm。（b） Veh、Hal或Hal加KW6002治疗的小鼠背纹状体单个共焦切片中P-235/236-rpS6免疫反应神经元的定量(^**第页<0.01与车辆；°°第页<0.01与哈尔）。

图5
克α_嗅觉-氟哌啶醇诱导的核糖体蛋白S6（rpS6）磷酸化需要介导的信号传导。野生型(侏儒^+/+)和侏儒^+/−用氟哌啶醇（0.5mg/kg）处理小鼠，分别于15min和60min后灌流。（a） G公司α_嗅觉野生型纹状体背侧共焦切片的免疫反应性侏儒杂合的(侏儒^+/−)鼠标。注意G的减少α_嗅觉纹状体的免疫反应侏儒^+/−鼠标。比例尺=50μm。（b）大鼠背侧纹状体单个共焦切片中的磷酸Ser235/236-rpS6（P-235/236-rpS6）免疫反应性*Gnal公司*^+/+或侏儒^+/−老鼠。比例尺=30μm。（c）纹状体P-235/236-rpS6免疫反应神经元的定量侏儒^+/+和侏儒^+/−小鼠给药溶媒（Veh）或氟哌啶醇（Hal）后15和60分钟(^**第页<0.01与车辆；°°第页<0.01vs侏儒^+/+).

图6
蛋白激酶A（PKA）信号传导对核糖体蛋白S6（rpS6）磷酸化的影响。培养纹状体神经元磷酸化-Ser235/236-rpS6的Western blot分析。顶部面板显示典型的自动射线图。底部面板是以平均值±SEM表示的数据摘要(n个=4). （a）纹状体神经元用载体（Veh）（A2AR激动剂5′）治疗15分钟-(N个-环丙基）甲酰胺腺苷（CPCA，10μM）或CPCA加上PKA抑制剂H-89二盐酸盐水合物（50μM，在CPCA前15分钟加入）。（b）用Veh或cAMP类似物Sp-5,6-DCl-cBIMPS（cBIMPS，200μM）处理纹状体神经元15分钟。(^**第页<0.01与车辆；°°第页<0.01与CPCA）。

图7
多巴胺和cAMP调节的32 kDa磷酸蛋白（DARPP-32）中Thr34突变为Ala可阻止氟哌啶醇诱导的组蛋白H3磷酸化。野生型和T34A突变小鼠用溶媒（Veh）或氟哌啶醇（Hal；0.5 mg/kg）治疗，并在15和60分钟后灌注。（a）用氟哌啶醇（0.5 mg/kg）治疗并在15或60分钟后处死的野生型小鼠纹状体中磷酸化-Thr34-DARPP-32（P-DARPP-32）的Western blot分析。顶部面板显示了使用抗P-DARPP32（上部）和总DARPP-3.2（下部）抗体获得的代表性自射线图。底部面板是以平均值±SEM表示的数据摘要(n个=5–7) (^*第页<0.05与车辆）。（b）用Veh或Hal治疗的小鼠纹状体无P-DARPP-32免疫反应的代表性放射自显影。（c和d）用Veh或Hal处理野生型或T34A DARPP-32突变小鼠，并在15或60分钟后灌注。（c）野生型或T34A突变小鼠背侧纹状体单个共焦切片中的磷酸Ser235/236-核糖体蛋白S6（P-235/236-rpS6）免疫反应性。比例尺=30μm。（d）野生型或T34A DARPP-32突变小鼠（T34A）服用Veh或Hal 15或60分钟后，背纹状体P-235/236-rpS6免疫反应神经元的定量(^**第页<0.01与车辆；°°第页<0.01与野生型）。

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