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.2011年9月9日；412(1):94-110.
doi:10.1016/j.jmb.2011.07.033。 Epub 2011年7月22日。

富含亮氨酸重复激酶2（LRRK2）GTPase结构域中的自磷酸化修饰激酶和GTP结合活性

菲利普·韦伯 1, 阿彻·D·史密斯, 索拉巴·森, 马修·伦弗洛, 詹姆斯·莫布里, 安德鲁·韦斯特
附属公司

富含亮氨酸重复激酶2（LRRK2）GTPase结构域中的自磷酸化修饰激酶和GTP结合活性

菲利普·韦伯等。 分子生物学杂志. .

勘误表in

摘要

富含亮氨酸的重复激酶2（LRRK2）蛋白具有鸟苷三磷酸酶（GTPase）和激酶活性，任一酶域的突变都可能导致迟发性帕金森病。GTPase结构域中的核苷酸结合可能是激酶活性所必需的，GTPase区域中的残基是潜在的自磷酸化位点，这表明存在复杂的内在调节机制。为了进一步确定LRRK2自身磷酸化的影响，我们应用了一种最适合检测蛋白质磷酸化、电子转移解离的技术，并仅在GTPase结构域的核苷酸结合口袋附近鉴定了自身磷酸化事件。帕金森病相关突变改变激酶活性，但不改变自身磷酸化位点特异性或强健体外底物髓磷脂碱性蛋白中的磷酸化位点。GTPase结构域中的氨基酸取代对激酶活性有很大影响，因为插入GTPase相关的R1441C致病突变和G2019S激酶结构域突变导致活性倍增（约7倍）。通过突变丙氨酸残基去除保守的自身磷酸化位点（T1503）导致GTP结合和激酶活性大大降低。虽然自磷酸化可能有助于增强激酶活性，但我们发现活性二聚体物种的寡聚和丢失以ATP和自磷酸化无关的方式发生。LRRK2自磷酸化位点在体外总体上受到强有力的保护，免受去磷酸化的影响，这表明对体内活性的严格控制。我们开发了针对pT1503的高度特异性抗体，但未能检测到来自转基因小鼠和细胞系的蛋白质中的内源性自身磷酸化。体内LRRK2活性不太可能是构成性的，而是根据特定反应进行细化。

PubMed免责声明

数字

图1
图1。G2019S突变体和WT-LRRK2的自磷酸化谱
A） 体外在100 nM浓度下使用指示的LRRK2（Δ1–970）酶和30°C下使用100μM ATP进行激酶分析，并通过SDS-PAGE解析反应。暴露于放射自显影胶片后，从干燥凝胶中切除条带。B）成立32P进入LRRK2蛋白带A类通过液体闪烁测量，并校正计数效率，并归一化为标准曲线，测定每个时间点每个LRRK2的平均磷酸盐。误差线代表±S。E.M.30分钟后未发现明显的额外合并。C）用100μM LRRKtide肽处理重组LRRK2Δ1–970和全长（FL）蛋白，达到激酶分析中指定的时间间隔。32通过液体闪烁测定肽中P的掺入。针对每种情况，将所示间隔期间的活动标准化为前20分钟间隔内的活动。”“游离”表示LRRK2以可溶性形式存在的条件“固体表面”表示LRRK2蛋白与琼脂糖珠结合的反应。误差线代表±S。E.M.公司。D）在指定的时间内进行激酶反应，并通过银染SDS-PAGE凝胶和天然PAGE蓝色凝胶进行分析。
图2
图2。致病性G2019S突变不改变ROCO结构域中LRRK2自身磷酸化的特异性
LRRK2型体外在存在100μM ATP的情况下，用100 nM G2019S（激酶活性）、WT或D1994A（激酶死亡）LRRK2蛋白（Δ1–970）进行30分钟的激酶分析。A）反应通过SDS-PAGE解决，Pro-Q钻石染色强调30分钟后LRRK2蛋白的磷酸化体外激酶分析。使用台风三联扫描仪检测到荧光。B）ATP处理的和原始的LRRK2蛋白在相同的凝胶上运行，并测量苏氨酸残基的磷酸化C–H）激酶反应通过SDS-PAGE进行解析，考马斯染色带用LysC、糜蛋白酶或胰蛋白酶消化。给出了指定磷酸化残基所需的最小光谱。在大多数情况下，多种高质量肽（表1）证实了这一分配。蓝色文本突出显示预期的匹配值。在G2019S和WT-LRRK2蛋白中均检测到相同的磷酸化残基，但在D1994A-LRRK2蛋白中未检测到磷酸化残基。C）1343磷酸化肽的典型CID光谱。D–H）来自其他已鉴定的LRRK2磷酸化肽的代表性ETD光谱。
图3
图3。LRRK2自动磷酸化主要发生在GTP结合囊中
A–C）LRRK2 GTPase结构域的卡通模型，在检测到的位点进行自动磷酸化。N=蓝色，O=红色，P=橙色，绑定GDP（紫色）以棒状格式显示，Mg2+离子（绿色）显示为球体。图片是用PyMOL创建的，域结构为2ZEJ（蛋白质数据库）D）LRRK2 GTPase结构域的线性表示说明了磷酸化（黄色标记）和结合囊内残基（红色）的位置以及晶体结构中未溶解的残基（灰色）。
图4
图4。自磷酸化特异性LRRK2抗体识别来自细胞系和组织的LRRK2中的pT1503蛋白
A）对来源于SF-9细胞的重组LRRK2Δ1–970进行磷酸化T1503检测，无论是否进行ATP处理。pT1503抗体的特异性通过与激酶死亡（KD，D1994）和幼稚LRRK2缺乏反应性来证明。B和C）从HEK-293FT细胞纯化的全长LRRK2蛋白用于检测总LRRK_2蛋白和磷酸化T1503。pT1503抗体的特异性通过与激酶死亡（KD，D1994）、拟磷酸T1503D和不可磷酸化的T1503A LRRK2的最小反应性来证明。D） 体外在用PPase1处理之前，用LRRK2重组蛋白进行激酶分析。用PPase1（2.5 U，其中0.1单位从10μM磷酸-MBP中去除0.5 nmol丝氨酸/苏氨酸磷酸盐）和舒尼替尼（500nM）处理自磷酸化LRRK2体外激酶分析。（++）表示LRRK2在激酶测定和磷酸酶处理期间均用舒尼替尼处理。E）来自BAC LRRK2-Flag G2019S小鼠组织的LRRK2蛋白的Western blots。用λ-磷酸酶处理细胞膜前后进行pT1503蛋白的蛋白质印迹。总LRRK2用anti-Flag测定。描述的定量来自3个独立实验。
图5
图5。ROC结构域的变化对LRRK2酶活性的影响
A和C)将与琼脂糖珠缀合的全长LRRK2蛋白在含有100μM LRRKtide底物的激酶反应缓冲液中孵育30分钟。从反应中去除珠，从珠中去除LRRK2，变性并通过SDS-PAGE进行解析，通过考马斯染色和伴随的放射自显影暴露来突出LRRK2蛋白。B和D)来自的激酶反应上清液A类和C类在P-81纤维素纸上发现含有磷酸化LRRKtide32用液体闪烁法测定P掺入量。给出了三个实验的结果，误差条代表±S。E.M.，n.s.不重要*与WT-LRRK2相比，表示p<0.001，这是通过Tukey事后检验的单向方差分析确定的。E）瞬时转染全长LRRK2的HEK-293FT细胞裂解液与γ-S-GTP琼脂糖微球结合。输入组分和GTP下拉组分通过SDS-PAGE和western blotting进行解析。F类)在4个独立实验中校正总蛋白水平（输入分数）后，在Alpha-Innotech Flurochem HD上测定原始发光值，去除背景信号，并将值标准化为T1348N LRRK2。误差线为±S。E.M.和*表示p<0.05，***表示p<.001（相对于WT），通过单向方差分析和Tukey的事后检验确定。
图6
图6。MBP磷酸化LRRK2位点的鉴定
A） 体外用WT或激酶死亡（D1994A）LRRK2（Δ1–970）的重组去磷酸化MBP进行激酶分析，用SDS-PAGE进行分析，用考马斯染色解析蛋白带。暴露于放射自显影胶片表明底物蛋白的相对磷酸化。B）在本研究中，使用质谱法鉴定的12个磷酸化残基周围的13mer肽序列，网络标识确定肽序列没有显著趋势。C–H） 体外由50 nM LRRK2（Δ1–970）和1μM脱磷酸MBP组成的激酶分析通过SDS-PAGE进行解析，用考马斯染色，主要MBP亚型切除并用LysC、胰蛋白酶或糜蛋白酶消化。检测到的肽和进行赋值所需的相应光谱以及磷酸化残基的身份都已给出。在所有情况下，多重高质量肽（未显示）证实了这一分配。
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