SLC6A14 (ATB0,+) protein, a highly concentrative and broad specific amino acid transporter, is a novel and effective drug target for treatment of estrogen receptor-positive breast cancer

doi:10.1074/jbc.M111.229518

.2011年9月9日；286(36):31830-8.

doi:10.1074/jbc。M111.229518。 Epub 2011年7月19日。

SLC6A14（ATB0，+）蛋白是一种高浓度、广谱特异性氨基酸转运体，是治疗雌激素受体阳性乳腺癌的新型有效药物靶点

Senthil Karunakaran公司¹, 萨巴里什·拉马钱德兰, Veena Coothandaswamy女士, 塞尔瓦库马尔·埃兰戈万, Ellappan巴布, Sudharsan Periyasamy-Thandavan公司, 阿什什·古拉夫, Jaya P Gnanaprakasam公司, 纳根德拉·辛格, 帕特里夏五世·舍恩莱因, 普图尔·德普拉萨德, Muthusamy Tangaraju, 瓦迪维尔·加纳帕西

附属公司

PMID： 21771784
预防性维修识别码：项目经理1173074
内政部： 10.1074/jbc。M111.229518号

SLC6A14（ATB0，+）蛋白是一种高浓度、广谱特异性氨基酸转运体，是治疗雌激素受体阳性乳腺癌的新型有效药物靶点

Senthil卡鲁纳卡兰等人。生物化学杂志. 2011.

.2011年9月9日；286(36):31830-8.

doi:10.1074/jbc。M111.229518。 Epub 2011年7月19日。

作者

Senthil Karunakaran公司¹, 萨巴里什·拉马钱德兰, Veena Coothanhandaswamy餐厅, 塞尔瓦库马尔·埃兰戈万, Ellappan巴布, Sudharsan Periyasamy-Thandavan公司, 阿什什·古拉夫, Jaya P Gnanaprakasam公司, 纳根德拉·辛格, 帕特里夏五世·舍恩莱因, 普图尔·德普拉萨德, Muthusamy Tangaraju, 瓦迪维尔·加纳帕西

附属

¹美国乔治亚州奥古斯塔乔治亚健康科学大学乔治亚医学院生物化学和分子生物学系，邮编30912。

PMID： 21771784
预防性维修识别码：项目经理1173074
内政部： 10.1074/jbc。M111.229518号

摘要

SLC6A14又称ATB（0，+），是一种具有独特特性的氨基酸转运体。它运输20种蛋白质生成氨基酸中的18种。然而，这种转运体仅在正常组织中低水平表达。在这里，我们发现转运蛋白在雌激素受体（ER）阳性的乳腺癌中特异性上调，在原发性人类乳腺癌组织和人类乳腺癌细胞系中可以证明。SLC6A14是雌激素/ER靶点。SLC6A14的转运特征包括亮氨酸（mTOR的激活剂）、谷氨酰胺（核苷酸生物合成的必需氨基酸和谷氨酰胺分解的底物）和精氨酸（肿瘤细胞的必需氨基酸）的集中转运，提示ER阳性乳腺癌细胞上调SLC6A14，以满足其对这些氨基酸的增加需求。因此，用SLC6A14的选择性阻断剂α-甲基-DL-色氨酸（α-MT）体外治疗ER阳性乳腺癌细胞，可诱导氨基酸剥夺，抑制mTOR，并激活自噬。α-MT治疗时间延长会导致细胞凋亡。在α-MT治疗期间添加自噬抑制剂（3-甲基腺嘌呤）也会诱导细胞凋亡。α-MT的这些作用对表达转运体的ER阳性乳腺癌细胞具有特异性。当SLC6A14被shRNA沉默时，α-MT引起氨基酸剥夺的能力在ER-阳性乳腺癌细胞系MCF-7细胞中显著减弱。在小鼠异种移植研究中，α-MT本身能够减少ER-阳性ZR-75-1乳腺癌细胞的生长。这些研究确定SLC6A14是治疗ER阳性乳腺癌的新的有效药物靶点。

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数字

**图1。**
**上调*SLC6A14型*ER阳性乳腺癌。** 一、RT-PCR分析原发性乳腺癌组织和相应的邻近正常组织中SLC6A14 mRNA。N个，正常；T型，肿瘤。B类ER阳性乳腺癌组织和正常乳腺组织中SLC6A14蛋白的免疫组化分析。C类人乳腺癌细胞系中SLC6A14和ERαmRNA的RT-PCR分析。*急诊室*⁺ *不列颠哥伦比亚省*ER阳性乳腺癌细胞株；*急诊室*⁻ *不列颠哥伦比亚省*，ER阴性乳腺癌细胞株。

**图2。**
**雌激素/ER对SLC6A14表达的调节。** 一ZR-75-1和BT-474细胞在对照培养基（10%胎牛血清加酚红）和无酚红培养基中培养5～6代(*下午。*; 10或5%炭样剥离胎牛血清），并通过RT-PCR测定ERα和SLC6A14 mRNA的水平。*第1页*,*第3页至第5页*、和*第1页至第6页*参考文章编号。B类用雌二醇处理BT-474细胞(*E2级*; 10牛顿米)有无抗雌激素（1μ米)24小时，然后用于SLC6A14和ERαmRNA的RT-PCR分析。ICI 182780也称为Faslodex。*TAM公司*，三苯氧胺；*4-羟基TAM*，4-羟基他莫昔芬。C类，BT-474细胞转染了*SLC6A14型*启动子（～3kb）-荧光素酶(吕克)构建或清空载体，然后用雌二醇（10n米)在有无抗雌激素（1μ米). 治疗后，对报告者的活动进行测量。数据表示转染效率差异的β-半乳糖苷酶活性归一化后的值。*美国犹他州*，未经治疗。

**图3。**
**纳⁺SLC6A14介导的亮氨酸转运的活化动力学(一)以及精氨酸和谷氨酰胺(B类).**人SLC6A14在*X·莱维斯*卵母细胞注射cRNA。注射后4天，用双微电极电压灯法对卵母细胞进行电生理研究。未注射的卵母细胞在与亮氨酸、精氨酸或谷氨酰胺（1 m米). cRNA注射的卵母细胞在与这三种氨基酸融合时显示出明显的内向电流，并且电流的大小随着钠浓度的增加而增加⁺.（Cl的浓度⁻在100米处保持不变米.）由于不同卵母细胞的表达水平不同，导致氨基酸诱导的电流大小不同，因此通过取100米处诱导的电流大小来归一化电流米纳⁺在每个卵母细胞中为1，并计算在其他Na浓度下诱导的电流大小⁺作为最大电流的一部分。实验用三个不同的卵母细胞进行，结果以平均值±S.E表示。插图、丘陵地带。

**图4。**
**氯⁻SLC6A14介导的亮氨酸、精氨酸和谷氨酰胺转运的活化动力学。**实验按照Na的描述进行⁺图3图例中的活化动力学。注射cRNA的卵母细胞在与这三种氨基酸周融合时显示出明显的内向电流，并且电流的大小随着Cl浓度的增加而增加⁻.（Na的浓度⁺在100米处保持不变米）用三个不同的卵母细胞进行实验，结果以平均值±S.E表示。

**图5。**
**阻断SLC6A14介导的亮氨酸转运(一)，谷氨酰胺(B类)和精氨酸(C类)α-MT。**注射人SLC6A14 cRNA的卵母细胞被100μ米亮氨酸、谷氨酰胺或精氨酸。含有氨基酸的卵母细胞在NaCl存在下的外周融合诱导内向电流，当NaCl被替换为N个-甲基-d日-葡聚糖(*NMDG公司*)氯化物。在NaCl存在下，相同的卵母细胞与氨基酸的再灌注再次诱导内向电流，但当在相同的缓冲液中进行相同氨基酸的灌注时，这些电流消失米α-甲基。

**图6。**
**α-MT阻断SLC6A14对乳腺癌细胞的作用。** 一对MCF-10A（一种非恶性乳腺上皮细胞系）、MCF-7（一种雌激素受体阳性乳腺癌细胞系）和MB-231（一种激素受体阴性乳腺癌细胞株）细胞进行2.5 m或不进行处理米α-MT作用24、48或72小时，然后用于分析天冬酰胺合成酶(*ASNS公司*)和CHOP mRNA水平。B类对MCF-7、MB-231和MCF-10A细胞进行2.5 m处理或不处理米α-MT 48小时，然后用于组成型表达的LC3的免疫细胞化学分析。C类，MCF-7细胞用(*面板b*和*c（c）*)或不带(*面板a*)α-MT（2.5米米)48小时，然后用于电子显微镜。箭头表明自噬前体和自噬体中细胞质和细胞器的隔离，以及星号表示浓缩染色质。N个，细胞核。

**图7。**
**α-MT对MCF-7细胞自噬的诱导作用。** 一，自噬体蛋白水解¹⁴C标记蛋白质。α-MT和3-MA的浓度（如果存在）分别为2.5和10 m米处理时间为48小时。蛋白质水解的程度由无蛋白上清液中的放射性测定。一与不含α-MT和3-MA的蛋白质水解显著不同(第页< 0.001);b条，与不存在α-MT和3-MA时的蛋白水解显著不同(第页< 0.05);*c（c）*与仅存在α-MT的蛋白水解显著不同(第页< 0.01).B类，用GFP-LC3表达质粒转染MCF-7细胞，24小时后，用α-MT（2.5 m米)存在或不存在3-MA（10 m米)48小时。在治疗结束时，固定细胞，并对体外表达的GFP-LC3点状定位的细胞百分比进行量化。一与对照组相比；b条与α-MT单独治疗相比；*c（c）*，与α-MT单独治疗相比；*，第页< 0.001.

**图8。**
**α-MT对对照MCF-7细胞和shRNA沉默MCF-7中天冬酰胺合成酶和CHOP mRNA水平的影响*SLC6A14型*.** 一，使用基于慢病毒的系统在MCF-7细胞中测试了五种不同的SLC6A14特异性shRNAs，以监测其沉默效果*SLC6A14型*以GAPDH作为内部对照，通过RT-PCR测定SLC6A14 mRNA水平。*c（c）*，控制。B类,*SLC6A14型*使用慢病毒系统用shRNA-4在MCF-7细胞中沉默，然后不使用或使用α-MT（2.5 m米，48小时）。从细胞中分离的RNA用于RT-PCR以监测天冬酰胺合成酶的水平(*ASNS公司*)和CHOP mRNA。

**图9。**
一α-MT对mTOR活性的影响。MCF-7和MB-231细胞在不使用或使用α-MT（2.5 m米)24、48或72小时，细胞裂解物用于Western印迹。*S6K-P系列*，磷酸化S6激酶。*B–D类*α-MT加或不加3-MA对细胞死亡的影响。B类在不使用或使用α-MT（2.5 m米)，3-MA（10米米)或α-MT（2.5 m米)加上3-MA（10米米)并对碘化丙啶引起的细胞死亡进行了分析(*圆周率*)染色和基于FACS的细胞周期分析。C类，MCF-7细胞在不使用或使用α-MT（2.5 m）的情况下处理48 h米)，3-MA（10米米)或α-MT（2.5 m米)加上3-MA（10米米)然后通过膜联蛋白V标记分析凋亡细胞死亡。D类，MCF-7和MB-231细胞在不使用或使用2.5μ米α-MT作用24、48或72小时。然后，使用细胞裂解产物，使用特异识别蛋白水解产物的抗体，对层粘连蛋白A降解产物进行Western blot分析。β-肌动蛋白被用作内部控制。

**图10。**
**体内α-MT治疗ER阳性乳腺癌的疗效。**ZR-75-1型(一)，MCF-7(B类)和MB-231(C类)将细胞皮下注射到BALB/c裸鼠（10×10⁶细胞/注射部位）。对于MCF-7细胞，植入缓释雌激素颗粒以支持肿瘤生长。对于每个细胞系，对照组接受含蔗糖的水，处理组接受含蔗糖的水中的α-MT（2mg/ml）。定期测量肿瘤大小。*NS公司*，无统计学意义(第页> 0.05); *,第页<0.005（双尾非配对学生t吨测试）。D类，BALB/c裸鼠分为两组；对照组饮用含蔗糖的水，治疗组饮用含糖水中的α-MT（2mg/ml），持续2周。然后给小鼠放血，并通过HPLC测定血浆中的α-MT。*未注明日期。*，未确定。

**图11。**
**雌激素依赖性抑制α-MT诱导MCF-7细胞中天冬酰胺合成酶和CHOP表达的功效。**MCF-7细胞在无或有雌二醇的苯酚无红培养基中培养(*E2级*; 10牛顿米)24小时，然后在不使用或使用α-MT（2.5 m）的情况下进行处理米，24小时）。这些细胞用于分析SLC6A14，天冬酰胺合成酶(*ASNS公司*)RT-PCR检测CHOP mRNA水平。HPRT1 mRNA水平作为内部对照。

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