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.2011年8月19日；286(33):28833-28843.
doi:10.1074/jbc。M111.233932。 Epub 2011年6月27日。

组蛋白脱乙酰酶9缺乏对效应T细胞介导的系统性自身免疫的保护作用

Kailin Yan公司 1, 羌曹 1, 克里斯托弗·莱利 2, 尼古拉斯·L·杨 三, 本杰明·加西亚 三, 尼拉马达布·米什拉 4
附属公司

组蛋白脱乙酰酶9缺乏对效应T细胞介导的系统性自身免疫的保护作用

Kailin Yan公司等。 生物化学杂志. .

摘要

共加压组蛋白去乙酰化酶9（HDAC9）在包括调节性T细胞在内的多种细胞的发育和分化中起着关键作用。然而，HDAC9在T效应细胞中的生物学功能尚不清楚。狼疮、糖尿病和类风湿关节炎等系统性自身免疫性疾病具有功能失调的效应T细胞。为了确定HDAC9在全身自身免疫中的作用，我们创建了HDAC9缺乏的MRL/lpr小鼠，这些小鼠具有异常的效应T细胞功能。HDAC9缺乏导致MRL/lpr小鼠淋巴增殖、炎症、自身抗体生成减少，生存率增加。与HDAC9完整的MRL/lpr小鼠相比，HDAC9缺陷小鼠表现出Th2极化，诱导型共刺激物阳性的T效应滤泡细胞减少，体内T细胞激活。HDAC9缺乏还导致GATA3和roquin增加，BCL6基因表达降低。HDAC9缺乏与全球H3（H3K9、H3K14和H3K18）的位点特异性赖氨酸组蛋白乙酰化增加相关，该乙酰化分别定位于IL-4、roquin和过氧化物酶体增殖物激活受体γ启动子，基因表达增加。在肾脏和脾脏中，由于过氧化物酶体增殖物激活受体γ过表达，HDAC9缺乏降低了炎症、细胞因子和趋化因子的产生。这些发现表明，HDAC9在效应T细胞介导的系统性自身免疫中起着表观遗传开关的作用。

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数字

图1。
图1。
HDAC9缺乏降低MRL/lpr小鼠脾脏中的DNT细胞、活化T细胞和浆细胞。通过标准细胞计数和/或流式细胞术对脾脏和淋巴结WT和KO小鼠的白细胞数量进行量化和/或表型分析。A类，用于图形的代表性流式细胞仪图(B)用于活化的T细胞（CD4+CD69型+)和CD138浆细胞如图所示。图中代表了每个菌株中的六只小鼠。*，第页< 0.05; **,第页< 0.01. 脾脏和淋巴结中分析的其他细胞类型详见补充表2.
图2。
图2。
HDAC9缺乏可降低MRL/lpr小鼠蛋白尿、肾脏疾病的严重程度和死亡率。 A类，MRL中的尿蛋白/液化石油气HDAC9缺乏可减少小鼠的体重。按照“实验程序”中的描述，对尿蛋白水平进行半定量评估和分级BWT肾脏的苏木精和伊红染色切片(顶部)和KO(底部)展示的是老鼠。每个小组来自不同的动物代表，即20周龄时从不同组中检测的10-12只雌性小鼠。C类，20周龄雌性WT和KO小鼠的肾小球指数得分是由一位对各组盲的病理学家根据之前已知的标准，通过对苏木精和伊红染色的肾切片进行组织学分析来确定的；*，第页< 0.05; **,第页< 0.01.D类直接免疫荧光法测定补体C3的肾小球免疫沉积(顶部)和IgG(底部)在WT和KO小鼠的冷冻肾切片中，以盲法对染色强度进行评分(E类和F类).G公司，存活率在野生野生野生野生(n个=22）和KO(n个=20）通过观察小鼠长达40周，并在其奄奄一息时将其处死。
图3。
图3。
HDAC9调节MRL/lpr小鼠滤泡和滤泡外T效应细胞中表达的基因。 A类，显示CD4中ICOS mRNA的实时PCR分析+KO小鼠的T细胞与WT小鼠的比较。B，代表性流式细胞仪曲线用于图表C用于B220−CD4细胞+CD44细胞高的国际博协+将KO小鼠脾细胞上的T细胞与WT小鼠进行比较。D类，CD4的代表性流式细胞仪图+CD44细胞高的CD62L型洛PSGL-1型洛用于图表E将KO小鼠和WT小鼠的脾细胞进行比较。F类实时PCR分析与KO和WT小鼠滤泡和滤泡外T细胞相关的指示基因的mRNA表达。G公司CD4中roquin mRNA的实时PCR分析+将KO小鼠的T细胞与WT小鼠进行比较。H（H）所示为roquin的Western blot分析（来自每组三只小鼠的混合样品），表明KO小鼠中的表达增加，与roquin mRNA表达一致；数据代表了两个独立的实验。我对KO和WT小鼠的脾细胞进行ChIP分析。用总IgG、AcH3、Ac-H3K9和AcK18抗体免疫沉淀染色质。引物侧翼为roquin基因，用PCR分析沉淀DNA。非免疫沉淀样品用作输入控制。图中显示了每组三只小鼠的两个独立实验的代表性数据。J型，实时PCR分析显示CD4中miRNA-101增加+KO小鼠的T细胞与WT小鼠的比较。miRNA-101表达正常化以控制miRNA-U6。实时PCR(K（K）)和Western blot分析(L（左）)与WT小鼠相比，KO小鼠脾细胞中BCL6的表达降低。结果表示每组六只动物的平均值±S.E.。*，第页< 0.05; **,第页<0.01（学生的吨测试）。
图4。
图4。
HDAC9缺乏降低T细胞活化并有利于Th2极化体内和体外在MRL/lpr小鼠中。 A类，20周龄野生动物血清中细胞因子水平(n个=13）和KO(n个=13）小鼠通过ELISA测定。结果表示为细胞因子的平均浓度±S.E。B，幼稚CD4产生的分泌细胞因子+抗CD3和抗CD28单克隆抗体刺激WT和KO细胞产生的T细胞(n个=每个基因型5）。C类，中的代表性流式细胞仪图图D产生IL-4-和IFN-γ的CD4+WT和KO小鼠的T细胞体外如图所示。数据代表了每组三只混合小鼠的两个独立实验。CD4细胞+KO小鼠T细胞产生的IL-4 mRNA增加(E类)以及更高百分比的产生IL-4的CD4+T细胞(F类)Th2-极化条件培养基中与WT小鼠的比较体外试验。G公司显示了白细胞介素-4基因在WT和KO中的局部启动子结构。对WT和KO小鼠的脾细胞进行ChIP分析。用总IgG、AcH3、Ac-H3K9和AcK18抗体免疫沉淀染色质。用IL-4基因启动子两侧的引物对沉淀的DNA进行PCR分析。非免疫沉淀样品用作输入控制。图中显示了每组三只小鼠的两个独立实验的代表性数据。*，第页< 0.05; **,第页< 0.01.
图5。
图5。
HDAC9-缺陷MRL/lpr小鼠的炎症细胞因子和趋化因子生成减少是由于PPAR-γ表达增加所致。脾细胞PPAR-γmRNA表达的实时PCR分析(A类)和肾脏(C类)显示了来自WT和KO小鼠的。结果表示每组六只动物的平均值±S.E.。*，第页< 0.05; **,第页<0.01（学生的吨测试）。所示为脾细胞PPAR-γ蛋白表达的Western blot分析(B)和肾脏(D类)来自WT和KO小鼠。E类显示了PPAR-γ启动子上H3Ac、H3K9Ac和H3K18Ac修饰的ChIP-定量PCR分析。对KO和WT小鼠的脾细胞进行ChIP分析。用总IgG、AcH3、Ac-H3K9和AcK18抗体免疫沉淀染色质。使用带有PPAR-γ启动子侧翼的引物，使用SYBR绿色染料进行定量ChIP。数据是三个重复的平均值误差线代表S.E.显示了每组三只小鼠的两个独立实验的代表性结果。表1和表2总结了KO和WT小鼠脾细胞和肾脏中PPAR-γ依赖基因的实时PCR数据。结果表示每组6只动物的平均值±S.E.。*，第页< 0.05; **,第页<0.01（学生的吨测试）。
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