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.2011年7月5日；108(27):11121-6.
doi:10.1073/pnas.1107969108。 Epub 2011年6月20日。

氨诱导的自噬独立于ULK1/ULK2激酶

Heesun Cheong先生 1, 图莉亚·林德斯滕, 吴俊敏, 赵璐, 克雷格·B·汤普森
附属公司

氨诱导的自噬独立于ULK1/ULK2激酶

熙善昌等。 美国国家科学院程序. .

勘误表in

  • 美国国家科学院院刊2011年10月25日；108(43):17856

摘要

自噬是一种溶酶体介导的分解代谢过程，有助于维持细胞内稳态和细胞对代谢应激的反应。在酵母中，已经确定了执行自噬所必需的基因，包括自噬相关基因1（ATG1），一种负责雷帕霉素靶下游自噬启动的激酶。在这里，我们通过产生ULK1和ULK2双重缺陷的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）来研究哺乳动物Atg1同源物，即不协调家族成员（unc）-51-like kinase 1和2（ULK1 and ULK2）在自噬中的作用。我们发现，ULK1/2在氨基酸剥夺的自噬反应中是必需的，但在葡萄糖剥夺或葡萄糖代谢抑制诱导的自噬者中则不是必需的。这种ULK1/2依赖性自噬不是生物能量折衷的简单结果，并且不能被AMP激活的蛋白激酶激活剂如5-氨基咪唑-4-羧酰胺核糖和苯乙双胍诱导。相反，我们发现，葡萄糖缺乏引起的自噬诱导与氨基酸分解代谢升高引起的细胞氨水平升高有关。即使在完全培养基中，氨也会在WT和Ulk1/2（-/-）MEF中诱导自噬，但在缺乏Atg5的MEF中没有。丙酮酸通过丙酮酸转化为丙氨酸清除多余的氨而产生的细胞可渗透形式的丙酮酸消除了对氨的自噬反应。因此，尽管ULK1和/或ULK2是剥夺含氮氨基酸后的自噬反应所必需的，但对剥夺葡萄糖或直接接触氨所引起的增强的氨基酸分解代谢的自噬反应并不需要ULK1或ULK2。总之，这些数据表明，自噬为细胞提供了一种机制，不仅可以适应氮缺乏，还可以适应氮过量。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
Ulk1/2对于氨基酸缺乏的自噬反应是必需的，但对于葡萄糖缺乏的反应则不是必需的。GFP-LC3–表达WT、Ulk1/2 DKO（Ulk1/2−/−)和Atg5 KO（Atg5−/−)MEF在完全培养基中培养24小时，然后不进行处理，或遭受氨基酸饥饿（−AA）6小时或葡萄糖饥饿（−-Glc）24小时，如材料和方法. (A类)用荧光显微镜测定自噬活性。测定含有>20个GFP-LC3点的细胞的百分比。(B类)免疫印迹法检测LC3从细胞溶质LC3（LC3-I）到脂质结合LC3（LC3-II）的转化以及磷酸化p70 S6激酶（pS6K）、总p70 S6-激酶（S6K）和微管蛋白的存在。(C类)实验的LC3-II/LC3-I转换比如所示B类由Image J（美国国立卫生研究院）进行量化。
图2。
图2。
Ulk1/2不需要用于生物能量应激的自噬反应。WT，Ulk1/2 DKO（1/2−/−)和Atg5 KO（5−/−)表达GFP-LC3的MEF在完全培养基中培养，然后进行葡萄糖饥饿（−Glc）或用10 mM 2DG、1 mM二甲双胍或2 mM AICAR处理24小时。通过免疫印迹法测定GFP-LC2的处理情况，以监测自噬。此外，还对phopo-p70 S6激酶（pS6K）、p70-S6激酶（S6K）和磷酸-AMPK（pAMPK）、总AMPK、磷酸-ACC（pACC）、总ACC和微管蛋白进行免疫印迹。星号表示非特定带。
图3。
图3。
氨刺激mTOR依赖性自噬。(A类)葡萄糖缺乏，而不是氨基酸饥饿，会增加氨的生成。用Nova生物医学Flex分析仪测定培养24小时的细胞培养基中的氨含量*P（P）< 0.05. (B类)NH公司4氯处理增加自噬，但不影响mTOR活性。用不同浓度的NH处理表达GFP-LC3的WT MEF4通过GFP-LC3处理和LC3转化测定24小时完全培养基中的Cl。通过磷酸化p70 S6激酶（pS6K）免疫印迹法评估mTOR活性。(C类)氨诱导自噬需要Atg5，而不是Ulk1/2。表达GFP-LC3的野生型，Ulk1/2 DKO（1/2−/−)和Atg5 KO（5−/−)用2 mM NH处理MEF4通过GFP-LC3处理的免疫印迹法测定24 h Cl的自噬率。(D类)NH的剂量4诱导自噬的氯对细胞活力没有影响。在下列条件下培养48小时后C类，通过碘化丙啶（PI）排除法测定细胞活力。
图4。
图4。
氨基葡萄糖治疗后产生的氨会诱导自噬。(A类)显示氨基葡萄糖代谢过程中氨生成的图表。(B类)WT，Ulk1/2 DKO（1/2−/−)和Atg5 KO（5−/−)表达GFP-LC3的MEF在含有10 mM葡萄糖胺（GlcN）的完整培养基中培养24小时。用Nova生物医学Flex分析仪测量细胞培养上清液中的氨水平*P（P）< 0.05. (C类)氨基葡萄糖治疗增加自噬。在24小时时通过GFP-LC3处理确定自噬，如B类.
图5。
图5。
MP可消除氨诱导的自噬。自噬诱导(A类)氨基葡萄糖（GlcN）或(B类)NH公司4MP处理可抑制Cl。WT，Ulk1/2 DKO（1/2−/−)和Atg5 KO（5−/−)在药物治疗前，表达GFP-LC3的MEF在完全培养基中培养24小时。将MP（20 mM）与10 mM氨基葡萄糖一起添加24小时(A类)或2 mM NH4氯离子(B类)。免疫印迹法检测GFP-LC3的表达，以评估自噬。(C类)培养24小时后，细胞培养基中的丙氨酸相对水平如A类在WT MEF中通过GC-MS分析进行测量。Com，全介质*P（P）< 0.05.
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