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.2011年6月10日；145(6):926-40.
doi:10.1016/j.cell.2011.04.029。

旁分泌和自分泌信号诱导并维持乳腺中的间充质和干细胞状态

克里斯蒂娜·谢尔 1, 埃莉诺·恩·伊顿, 索菲娅·辛钟丽, 克里斯汀·夏弗, 费伦斯·莱因哈特, 孔洁嘉, 乔治·贝尔, 郭文军（Wenjun Guo）, 家鲁宾, 安德烈亚·理查森, 罗伯特·温伯格
附属公司

旁分泌和自分泌信号诱导并维持乳腺中的间充质和干细胞状态

克里斯蒂娜·谢尔等。 单元格. .

摘要

上皮-间充质转化（EMT）与运动性、侵袭性和自我更新特征的获得有关。在正常发育和肿瘤发病过程中，上皮细胞从其微环境接收到的背景信号会导致细胞表型的改变。导致EMT和维持细胞状态的信号尚不清楚。我们描述了三种信号通路，包括转化生长因子（TGF）-β和规范和非规范Wnt信号通路，它们协同诱导EMT程序的激活，然后以自分泌方式发挥作用，以维持所产生的间充质状态。下调上皮细胞自分泌信号的内源性合成抑制剂可以诱导EMT程序。相反，通过添加这些通路抑制剂破坏自分泌信号，抑制原代乳腺上皮细胞的迁移和自我更新，并通过其转化衍生物降低致瘤性和转移性。

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数字

图1
图1。从永生化人乳腺上皮细胞（HMLE）中分离的间充质亚群（MSP）
（A） 亮相显微镜：MACS-纯化HMLE24+HMLE过度表达Twist（HTwist）和重新附着的MSP细胞。（B） 免疫荧光：HMLE中粘附连接蛋白E-cadherin和紧密连接蛋白ZO-124+、HTwist和MSP细胞。（C） 免疫荧光：间充质中间丝波形蛋白和上皮细胞角蛋白（panCK=泛细胞角蛋白抗体），纤维连接蛋白和Twist的表达。（D） 免疫印迹：E-和N-钙粘蛋白，EMT TFs ZEB1，Snail和Slug，负载控制：β-肌动蛋白。（E） 流式细胞术：CD44-APC和CD24-PE细胞表面染色。数字表示CD44的百分比你好/CD24型−人口。（F） 哺乳动物试验：亮相显微镜图像和亲代HMLE的定量24+、HTwist和MSP以及FACS纯化的CD44你好/CD24型−和CD44−中等（ium）/CD24型+HMLE细胞；n=12。（G） 迁移分析：显微图像和量化；n=3。
图2
图2。EMT相关自分泌信号
（A） ELISA：HMLE分泌TGF–β124+，HTwist和MSP细胞，n=3。（B） 荧光素酶报告子分析：Smad转录活性：用SBE4-luc报告质粒转染细胞，萤火虫荧光素酶水平归一化为pGL-SV40肾小球转染对照，n=3。（C） 免疫印迹：HMLE中Smad2磷酸化24+、HTwist和MSP细胞。负载控制：β-肌动蛋白。（D） 免疫印迹：Smad2磷酸化，负载控制：β-肌动蛋白。细胞在全培养基（++）中培养24小时，生长因子减少90%（+）或无生长因子（−）。（E） RT-PCR：与HMLE相关的BMP拮抗剂Gremlin、Chordin样2的mRNA表达24+细胞。（F） 免疫荧光：BMP拮抗剂和配体对Smad2/3核易位的调节。HMLE公司24+TGF–β1（低：0.3ng/ml，高：2.5ng/ml）单独或与Chordin-like 2、Gremlin（均为2.5μg/ml）或BMP4（0.5μg/ml）一起刺激细胞30min。（G） RT-PCR：DKK1-mRNA表达，ELISA：DKK1-蛋白分泌，n=3。（H） RT-PCR：SFRP1-mRNA表达。（一） RT-PCR：Axin2-mRNA表达。（J） 荧光素酶报告物分析（TOPFlash）：用Super（8x）TOP（TCF-LEF报告物）或FOP构建物（突变结合位点）转染细胞。所示为FOP萤火虫荧光素酶活性的TOP，归一化为pGL-SV40肾小球转染对照，n=3。（K） 抑制TOPFlash活性：将DKK1或SFRP1蛋白（1.0μg/ml）添加到HTwist和MSP的生长培养基中12h，n=3。（五十） 免疫印迹：与非规范Wnt信号相关的PKC和JNK通路。磷酸化JNK抗体产生非特异性的底带，星号指向磷酸化SAPK/JNK亚型。负载控制：β-actin
图3
图3。自分泌信号控制迁移和乳房层形成
（A） 迁移试验：将DKK1或SFRP1蛋白（0.5μg/ml）添加到生长培养基中；#HMLE对照组与HTwist和MSP对照组，p<1×10−6*HTwist或MSP对照组与DKK1或SFRP1治疗组，p<1×10−6，n=3。（B） 迁移试验：DKK1或SFRP1蛋白在指定浓度（μg/ml）下对迁移的剂量依赖性抑制，n=3*H-Twist或MSP对照组与DKK1或SFRP1治疗组比较，p<1×10−6**H-Twist或MSP，高浓度与低浓度，p<1×10−7，n=3。（C） 迁移试验：在指定浓度（μg/ml）下，重组BMP4蛋白对迁移的剂量依赖性抑制*HTwist或MSP对照，p<0.05，**0.6μg/ml vs.1.2μg/ml，p<1×10−4，n=3。（D） 哺乳动物球形成：在成球过程中（5d），每天以指定浓度（μg/ml）添加DKK1、SFRP1或BMP4蛋白*HTwist或MSP对照组与治疗组，p<0.01，**低浓度与高浓度或重组蛋白，p<0.05，n=8。（E） 第二乳球形成：在第一乳球形成（5d）期间每天添加DKK1（1μg/ml）、SFRP1（1μg/ml）和BMP4（0.5μg/ml*H-Twist或MSP对照组与治疗组，p<0.01，**一级球数与二级球数，p<001，n=16。（F） 哺乳动物实验：在乳房形成过程中（5d），每天用（B）中描述的蛋白质处理HTwist细胞，D+B:DKK1和BMP4一起添加，S+B:SFRP1和BMP4-一起添加*对照组与单一治疗组，p<1×10−5单次治疗与双次治疗，p<0.01，n=6。（G） 迁移试验：在DKK1（1μG/ml）、SFRP1（1μG/ml）、BMP4蛋白（0.5μG/ml*对照组与单一治疗组，p<1×10−5单次治疗与双次治疗，p<0.01，n=3。
图4
图4。自分泌信号控制肿瘤发生和转移
（A） 迁移试验：向生长培养基中添加SFRP1（1μg/ml）和BMP4蛋白（0.5μg/ml*对照组与单一治疗组，p<1×10−8，**单次与双次SFRP1和BMP4治疗（S+B），p<1×10−4，n=3。（B） 瘤球实验：在初级球体形成（5d）过程中，每天添加SFRP1（1μg/ml）和BMP4蛋白（0.5μg/ml#对照主要球体形成与次要球体形成，p=0.001*对照组与单一治疗组，p<1×10−4**单次与双次SFRP1和BMP4治疗（S+B），p<0.01，n=6。（C） 术后原位肿瘤形成体外治疗：将（B）中产生的原发性肿瘤球合并、分离并1.0×105细胞植入小鼠乳腺脂肪垫；所示为肿瘤重量，*表示无肿瘤，n=5只小鼠/组。（D） 肺转移：荧光显微镜下左肺主叶放大插图显示GFP阳性转移灶。（E） 肺表面转移灶的定量分析*对照组与SFRP1治疗组，p<0.05，**SFRP1与BMP4或双重治疗组（S+B），p<0.05，n=5只小鼠/组。（F） 肝转移：如（D）所述，植入细胞后，荧光显微镜图像和放大的肝脏表面插图显示GFP阳性微转移灶。（G） 肝表面转移灶的量化：每只小鼠计算5个肝表面区域，*对照组与单次治疗组，p<0.05，**单次与双次治疗组（S+B），p<0.05，n=5只/组。（H） 致瘤性试验：将悬浮在含有SFRP1（1μg/ml）、BMP4（0.5μg/ml。此外，在植入后1、2、3和7天，瘤旁注射20μl PBS或含有重组蛋白的PBS。
图5
图5。为EMT诱导创造一个宽松的细胞外环境
（A） RT-PCR：N-钙粘蛋白、ZEB1和ZEB2的mRNA表达，均与未经处理的对照细胞（HMLE）相关24+-shGFP）。HMLE公司24+-shGFP或-shSFRP1（shRNA-介导的SFRP1敲除，图S5B）每天治疗3d：抗DKK1抗体（αDKK1，100μg/ml）、抗E-钙粘蛋白抗体（αEC，10μg/ml。将所有因素添加到HMLE中24+-shSFRP1构成诱导鸡尾酒（IC）。（B） 免疫荧光：对照组（HMLE）中E-cadherin、beta-catenin、vimentin和fibronectin的表达24+-shGFP和HMLE24+-shSFRP1），TGF–β处理的HMLE24+-shGFP和IC处理的HMLE24+-shSFRP1细胞（治疗14天）。（C） 哺乳动物（n=7）和（D）迁移分析（n=3）：如（B）所示生成的细胞：a和B表示独立处理的复制品，*对照组与TGF-β处理组，p<1×10−4，**对照组与IC治疗组，p＜1×10−9（E）哺乳动物（n=6）和（F）迁移试验（n=3）：如（B）所述停止治疗后，细胞扩增12代，然后接种到含有SFRP1（1μg/ml/d）、BMP4（0.5μg/ml/d）或两者（S+B）蛋白的试验中，*对照组对单次治疗，p<0.01，**单次对双次治疗（S+B），p<0.05。（G） 流式细胞术：对照组CD44-APC和CD24-PE细胞表面染色，TGF-β和IC处理的细胞生成如（B）所述。数字表示CD44的百分比你好/CD24型−人口。（H） 肺转移：如（B）所述停止治疗后，细胞扩增8代，用RAS转化；将细胞注入小鼠乳腺脂肪垫；对肺表面GFP标记的转移进行定量*对照组与所有其他组相比，p<0.05，n=5只/组。
图6
图6。富含自我更新和运动能力的原代乳腺上皮细胞（MEC）群体的特征
（A） 乳腺检测：乳腺的显微图像和FACS纯化MEC对乳腺形成的量化EPC−、MEC工程总承包+单层培养5d后，未分类MEC（图S6A）。在7天的时间内形成的初级球体被分解并播种以形成次级球体，n=48。（B） 迁移分析：迁移细胞的显微图像和量化，n=6孔。（C） 免疫荧光：间充质和上皮标记物在MEC中的表达EPC−、MEC工程总承包+单层培养5d后；波形蛋白、泛细胞角蛋白（panCK）、E-cadherin、ZO-1和（D）EMT-TF Twist、Slug和ZEB1以及（E）β-catenin和Smad2。（F） 哺乳动物试验：MECEPC−在用TGFBRI抑制剂A83-01、SB435142（SB43，均为10μM）和重组SFRP1（1μg/ml）预处理5d后，接种到试验中，n=24。（G） 迁移分析：MECEPC−如（C）所述，预处理5d后，接种到迁移分析中，n=6。
图7
图7。Wnt和TGF–β信号控制基底和管腔MEC之间的转换
（A） 哺乳动物试验：FACS纯化MEC工程总承包+在Wnt通路刺激因子（称为Wnt）（抗DKK1抗体（100μg/ml）、抗SFRP1抗体（2μg/ml）、重组Wnt5a（250ng/ml））的存在下培养3d，然后在额外存在重组TGF–β1（0.1ng/ml）、抗E-钙粘蛋白抗体（αEC，20μg/ml）或两者的组合下培养2d。二次球体是由一次球体的离解产生的*初级与次级成球细胞，p<0.0005，n=10。（B） 迁移分析：镀入Boyden Chambers MEC前工程总承包+按（A）所述进行处理，n=3。（C） 免疫荧光：MEC工程总承包+如（A）所述进行处理，并在没有进一步处理的情况下扩增2d：E-钙粘蛋白、ZO-1、β-连环蛋白、Smad2、Slug和p63的表达。（D） RT-PCR：MEC中p63、Slug、Axin2和E-cadherin的mRNA表达工程总承包+按照（A）所述进行处理后，在没有进一步处理的情况下进行2d的扩张。
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