Impaired nutrient signaling and body weight control in a Na+ neutral amino acid cotransporter (Slc6a19)-deficient mouse

doi:10.1074/jbc.M111.241323

.2011年7月29日；286(30):26638-51.

doi:10.1074/jbc。M111.241323。 Epub 2011年6月2日。

Na+中性氨基酸协同转运蛋白（Slc6a19）缺陷小鼠的营养信号传导受损和体重控制

安吉丽卡·布罗尔¹, 托尔斯滕·朱利奇, 杰西卡·范斯兰布洛克, 纳丁·蒂泽, 彼得·所罗门, 杰夫·霍尔斯特, 查尔斯·G·贝利, 约翰·拉斯科, 斯特凡·布勒尔

附属公司

PMID： 21636576
预防性维修识别码： PMC3143628型
内政部： 10.1074/jbc。M111.241323号

Na+中性氨基酸协同转运蛋白（Slc6a19）缺陷小鼠的营养信号传导受损和体重控制

安吉莉卡·布罗尔等。生物化学杂志. 2011.

.2011年7月29日；286(30):26638-51.

doi:10.1074/jbc。M111.241323。 Epub 2011年6月2日。

作者

安吉丽卡·布罗尔¹, 托尔斯滕·朱利奇, 杰西卡·范斯兰布洛克, 纳丁·蒂泽, 彼得·所罗门, 杰夫·霍尔斯特, 查尔斯·G·贝利, 约翰·E·J·拉斯科, 斯特凡·布勒尔

附属

¹澳大利亚首都地区0200，堪培拉，澳大利亚国立大学生物研究学院。Stefan.broer@anu.edu.au

PMID： 21636576
预防性维修识别码： PMC3143628型
内政部： 10.1074/jbc。M111.241323号

摘要

肠和肾中的氨基酸摄取是由多种氨基酸转运蛋白介导的。为了了解上皮中性氨基酸摄取在全身稳态中的作用，我们分析了缺乏顶端广谱中性（0）氨基酸转运蛋白B（0）AT1（Slc6a19）的小鼠。观察到一种常见的中性氨基酸尿，类似于由SLC6A19突变引起的人类Hartnup病。肠和肾刷状缘膜囊泡对中性氨基酸的钠依赖性摄取被取消。未检测到肽转运或其他中性氨基酸转运蛋白的代偿性增加。缺乏B（0）AT1的小鼠体重减轻。当适应标准的20%蛋白质饮食时，B（0）AT1缺陷小鼠在含有6或40%蛋白质的饮食中体重迅速下降。空腹后食物摄入引起的胰岛素分泌减弱。在肠道中，雷帕霉素（mTOR）通路哺乳动物靶点的氨基酸信号减少，而GCN2/ATF4应激反应通路被激活，表明上皮细胞中的氨基酸缺失。结果表明，上皮氨基酸摄取对最佳生长和体重调节至关重要。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
**基因靶向性的确认*Slc6a19系列*未受精小鼠。** 一，LacZ-Neo盒插入*Slc6a19系列*基因显示。B类，使用PCR检测靶向等位基因的基因型确认（引物对一和*c（c）*485 bp）或野生型等位基因（引物对b条和*c（c）*，201 bp）。C类，B的表达式⁰SDS-PAGE和Western blotting检测肾源性BBMV中AT1蛋白(*K（K）*)和小肠(我). 基因型(*Slc6A19系列*面板边缘显示了野生型（+/+）、杂合型（+/-）和纯合型（−/−））和分子量。

**图2。**
**B的免疫定位⁰肠和肾中的AT1。**B的表达⁰野生型检测到AT1蛋白(一和B类)和*Slc6a19系列*未合子小鼠(C类和D类)通过免疫荧光(绿色)肠上皮细胞顶膜(B类和D类)在肾近端小管的早期段(一和C类). 这个箭头在里面*面板A*表示肾小球旁近端小管的开始(克). 近端小管的顶端染色通过与*四分叶乳杆菌*凝集素(红色). 这个酒吧在中*右下角*表示10μm的距离。

**图3。**
**BBMV尿液氨基酸分析和转运分析。** 一收集野生型（+/+）和未合子（−/−）小鼠24h的尿液。样品中的氨基酸通过GC-MS进行分析，峰面积归一化为内控核糖醇的峰面积。显示了每种氨基酸最丰富的衍生物。三甲基硅基(*列车管理系统*)表示三甲基甲硅烷基残基的衍生化，前面的数字表示衍生化的多样性。该图显示了n个=每个基因型4只小鼠；野生型样品中的氨基酸含量低于检出限。B类显示了小鼠肾BBMV中亮氨酸转运的基本特性。吸纳[¹⁴C] 亮氨酸（0.1 m米)在有钠和无钠的野生型小鼠肾BBMV中进行了研究⁺为了建立内部负膜电位，囊泡预加载93 m米K（K）₂SO公司₄并在摄取实验前用缬霉素（Val，1μg/ml）处理。

**图4。**
**野生型和野生型BBMV对肾脏营养素的吸收*Slc6a19系列*未受精小鼠。** 一，放射性标记营养素的吸收（0.1 m米)在来源于野生型（+/+，黑色和*阴影条*)和*Slc6a19系列*未合子动物（−/−，灰色和*白色条*)当面(黑色和*灰色条*)和缺席(孵化和*白色条*)Na的⁺.B类和C类谷氨酰胺和组氨酸摄取（0.1 m米)测量单位为*Slc6a19系列*在场的未受精小鼠(*灰色条*)和缺席(*白色条*)Na的⁺并且在10m处米(B类)或50米米(C类)未标记的氨基酸或氨基酸类似物。D类，用于检测Na⁺-ASCT2（Slc1a5）、Na进行的依赖性抗转运活性⁺-依赖和Na⁺-在预加载20m的囊泡中测定谷氨酰胺的独立摄取米谷氨酰胺30min或留在对照缓冲液中。在每个实验中，至少三只动物的肾脏被汇集在一起，每只酒吧表示三个囊泡样品的平均值±S.D。野生型和*Slc6a19系列*未合子小鼠表示为*面板A*和D类以及未经禁止的控制*面板B*和C类.

**图5。**
**检测肾脏BBMV和倒置肠段的ASCT2和转运。** *面板A*用SDS-PAGE和Western blotting检测小鼠肾匀浆中的ASCT2（（Slc1a5）计算质量58-kDa单体和116-kDa-二聚体(*K（K）*)、BBMV和脑匀浆(英国).B类，从脑组织中提取蛋白质(*车道1*)，表达ASCT2的卵母细胞质膜(*车道2*)和未注射卵母细胞(*车道3*). 经SDS-PAGE分离后，将样品印在硝酸纤维素上，并用ASCT2抗血清（−）检测。在*下部面板*（+）将抗血清与免疫原性肽（2μg/ml）预孵育，阻断免疫反应。C类脑蛋白提取物分离后免疫印迹法检测ASCT2(英国)肠BBMV和肠组织匀浆(我)如图所示。D类脯氨酸和甘氨酸摄取（0.1 m米)在Na存在和不存在的情况下进行测量⁺以及在不存在和存在10m的情况下米未标记的氨基酸。每个实验中，至少有三只动物的肾脏被汇集在一起，每只酒吧表示三个囊泡样品的平均值±S.D。显示了与非禁止控制的显著差异。E类，Na中亮氨酸摄取活性⁺-含有钠⁺-在从3只不同的小鼠中随机选择的10块1cm长的小鼠小肠中测量自由缓冲液，并将其描述为*四分位盒须图*. TheSlc6a19系列基因型表示为+/+和−/−。

**图6。**
**小鼠肠道的营养吸收。**倒置肠段（1 cm）用放射性标记底物（0.1 m）孵育米)37°C下持续30秒。随后，在冰镇运输缓冲液中清洗切片三次，并通过闪烁计数测定结合活性。在有钠和无钠的情况下测量亮氨酸摄取⁺在里面*Slc6a19系列*野生型（+/+）、杂合型（+/-）和纯合型（−/-）肠道(一)以及在不存在和存在10m的情况下米精氨酸(B类).C类，在Na存在和不存在的情况下测量葡萄糖摄取⁺野生型、杂合型和*Slc6a19系列*未合子肠。D类，卵母细胞注射编码SGLT1，B的cRNA⁰AT1和ACE2。测量20分钟的葡萄糖摄取量，并减去每个病例中未注射对照卵母细胞的活性。E类，纳⁺-放射性标记营养素的依赖性吸收（每0.1m米)在野生型和*Slc6a19系列*未受精小鼠。F类，肌肽吸收（0.1 m米)在野生型和*slc6a19型*Na存在和不存在时的未合子小鼠⁺在每次运输实验中，至少收集三只动物的切片，每个切片酒吧表示三个肠段的平均±S.D。每个实验至少进行三次，结果相似。统计显著性与野生型活动有关*面板A*,B类,C类,E类、和F类或中的控制条件D类.

**图7。**
**小鼠肾脏和肠道刷状缘膜囊泡中营养物质转运蛋白及其辅助蛋白的免疫检测。**从肠道中分离出BBMV(我)和肾脏(*K（K）*)来源于野生型（+/+）、杂合型（+/-）和*Slc6a19系列*未合子（−/−）小鼠。通过SDS-PAGE分离蛋白质（30μg）。营养物质转运体和辅助蛋白通过Western blotting检测，使用特定抗体，稀释如下补充表1.

**图8。**
**野生型和*slc6a19型*未受精小鼠。**男性外观（54天大）(一)和雌性（79日龄）(C类)野生型和*Slc6a19系列*显示了未合子小鼠。男性的体重(B类)和女性(D类)混合型小鼠*Slc6a19系列*在84天的时间里，对野生型（+/+）、杂合型（+/-）和纯合型（−/-）窝进行了测量。在第22天断奶后测定基因型。在第22天之前，描述了所有三种基因型的平均体重。

**图9。**
**不同饮食对体重的影响。**野生型（+/+）和*Slc6a19系列*给未合子（−/−）小鼠喂食蛋白质含量分别为6%、20%和40%的等热量饮食。20%蛋白质饮食相当于标准的小鼠食物，没有观察到体重变化（未显示）。一，显示了6%蛋白质饮食下的体重发展。B类不同蛋白质含量日粮中体重下降与绝对体重的相关性*Slc6a19系列*显示了未合子小鼠。将10天后的体重减轻与实验开始时的体重进行对比。C类，体重发展恢复时*Slc6a19系列*未受精的小鼠从6%的蛋白质饮食恢复到20%的标准蛋白质饮食。D类，显示了40%饮食下的体重发展。E类，体重发展恢复时*Slc6a19系列*未受精的小鼠从40%的蛋白质饮食恢复到20%的标准蛋白质饮食。对重量痕迹进行平均，并绘制所示小鼠数量的平均值±S.D。在改为另一种饮食之前，饮食使用了12天。这个插入显示了单个小鼠在第10天到第50天之间的重量振荡，这在平均数据中无法识别。

**图10。**
**身体组织成分分析。**野生型小鼠的身体成分(一)和*Slc6a19系列*未合子小鼠(B类)采用双能x射线吸收分析。每个数据点代表一个单独的鼠标，是三次重复测量的平均值。标准饮食（20%蛋白质）和10天后不同蛋白质含量（6、20或40%）的饮食显示了每只小鼠的脂肪和瘦组织数量。第0天和第10天的测量值由以下公式连接线.

**图11。**
**肠道中的氨基酸信号转导。**从野生型和*Slc6a19系列*将未合子小鼠组合并均质，生成一个样本。用SDS-PAGE分离三个平行样品（每个100μg蛋白质），并将其印在硝酸纤维素上。随后，氨基酸信号通路的关键蛋白被特定抗体检测出来，如补充表1通过密度计对条带进行定量，并将其标准化为肌动蛋白对照，如直方图所示。*黑色条*表示野生类型数据，以及*白色条*代表*Slc6a19系列*未合子小鼠数据。

**图12。**
**胰岛素反应和*Slc6a19系列*mRNA在小鼠胰腺中的表达。** 一，野生型(*黑匣子*)和*Slc6a19系列*未受精动物(*白色方框*)禁食16小时。再次喂食前，采集血样，测定血糖和胰岛素水平。再次喂食1小时后，采集第二份血液样本并分析葡萄糖和胰岛素。使用的动物数量已标明。B类，快速分离小鼠胰腺，并用总RNA检测*Slc6a19系列*以及带有野生型特异引物的肌动蛋白（+/+）和*Slc6a19系列*未合子小鼠（−/−）。未添加RNA的反应（H₂O）用作控件。

**图13。**
**氨基酸在肠和肾中的转运概述。**重点是受删除*Slc6a19系列*“讨论”中提供了更多详细信息。*AA公司*，氨基酸；抄送，胱氨酸；*Glc公司*，葡萄糖。

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1. Matthews D.M.（1991）《蛋白质吸收》，第1版，威利莱斯，纽约
1. Nassl A.M.、Rubio-Aliaga I.、Fenselau H.、Marth M.K.、Kottra G.、Daniel H.（2011）《美国生理学杂志》。胃肠测试。肝脏生理学。，出版中-公共医学
1. Bröer A.、Klingel K.、Kowalczuk S.、Rasko J.E.、Cavanaugh J.、Bróer S.（2004）《生物学杂志》。化学。279, 24467–24476-公共医学
1. Böhmer C.、Bröer A.、Munzinger M.、Kowalczuk S.、Rasko J.E.、Lang F.、Bróer S.（2005）《生物化学》。J.389、745–751-项目管理咨询公司-公共医学
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[3] Nassl A.M.、Rubio-Aliaga I.、Fenselau H.、Marth M.K.、Kottra G.、Daniel H.（2011）《美国生理学杂志》。胃肠测试。肝脏生理学。，出版中-公共医学

[4] Nassl A.M.、Rubio-Aliaga I.、Fenselau H.、Marth M.K.、Kottra G.、Daniel H.（2011）《美国生理学杂志》。胃肠测试。肝脏生理学。，出版中-公共医学

[5] Bröer A.、Klingel K.、Kowalczuk S.、Rasko J.E.、Cavanaugh J.、Bróer S.（2004）《生物学杂志》。化学。279, 24467–24476-公共医学

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[7] Böhmer C.、Bröer A.、Munzinger M.、Kowalczuk S.、Rasko J.E.、Lang F.、Bróer S.（2005）《生物化学》。J.389、745–751-项目管理咨询公司-公共医学

[8] Böhmer C.、Bröer A.、Munzinger M.、Kowalczuk S.、Rasko J.E.、Lang F.、Bróer S.（2005）《生物化学》。J.389、745–751-项目管理咨询公司-公共医学

[9] Camargo S.M.、Makries V.、Virkki L.V.、Forster I.C.、Verrey F.（2005）《弗鲁格斯建筑》。451, 338–348-公共医学

[10] Camargo S.M.、Makries V.、Virkki L.V.、Forster I.C.、Verrey F.（2005）《弗鲁格斯建筑》。451, 338–348-公共医学

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