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.2011年8月；118(3):365-78.
doi:10.1111/j.1471-4159.2011.07330.x。 Epub 2011年6月17日。

垂体腺苷酸环化酶激活肽通过环腺苷酸反应元件结合蛋白调节的转录辅激活物1诱导活性依赖性信号传导，诱导长期神经保护

保罗·S·巴克斯特 1, 马克·安德烈·马特尔, Aoife麦克马洪, 彼得·C·金, 贾尔斯·E·哈丁汉姆
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垂体腺苷酸环化酶激活肽通过环腺苷酸反应元件结合蛋白调节的转录辅激活物1诱导活性依赖性信号传导，诱导长期神经保护

保罗·S·巴克斯特等。 神经化学杂志. 2011年8月.
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摘要

垂体腺苷酸环化酶激活肽（PACAP）是一种主要通过cAMP-蛋白激酶a（PKA）途径发挥作用的神经保护肽。这里，我们表明，在皮层神经元中，PACAP诱导的PKA信号通过触发动作电位（AP）放电间接发挥其主要神经保护作用，对PACAP的抗凋亡作用至关重要。短暂接触PACAP可在细胞凋亡损伤面前诱导长期神经保护，而细胞凋亡损伤依赖于AP放电和cAMP反应元件（CRE）结合蛋白（CREB）介导的基因表达的激活。尽管直接、活性无关的PKA信号足以触发CREB活化丝氨酸-133位点的磷酸化，但这不足以激活CREB介导的基因表达。完全激活依赖于CREB-调节转录辅激活物1（CRTC1），其PACAP诱导的核导入依赖于激活活性依赖的钙调神经磷酸酶信号。CRTC1的过度表达足以挽救PACAP诱导的CRE介导的基因表达，而显性阴性CRTC1干扰PACAP诱发的CREB介导的神经保护。因此，增强AP放电可能在PACAP和其他腺苷酸环化酶偶联配体的神经保护作用中发挥重要作用。

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数字

图1
图1
PACAP增强皮层神经元的AP放电。（a–d）PACAP预处理（此处和整个研究期间为10 nM PACAP-27）导致AP燃烧依赖性钙增加2+瞬态。根据PACAP±H-89（10μM）的指示对神经元进行治疗。2小时后，神经元接受Fluo-3 Ca2+监测钙大小的成像研究（详见方法）2+不同刺激条件下的瞬态。在指示位置添加TTX（1μM），以确定观察到的Ca2+瞬态是由动作电位触发引起的。显示了示例轨迹：黑线表示平均Ca2+细胞区域内的浓度，灰色阴影区域表示Ca的±SEM2+集中在那个领域。游离钙2+根据荧光信号计算浓度(F类)根据方程式[Ca2+] =K（K）d日(F类–F类最小值)/(F类最大值–F类)，并表示为K（K）d日Fluo-3（约为315 nM）。（d） 显示了（a–c）中所示数据的量化，即[Ca的平均振幅差异的量化2+]1μM TTX治疗前后。为了量化PACAP对放电活动诱导的[Ca的影响2+]流入，平均值2+]在TTX治疗前30 s和治疗后30 s计算对照神经元或经PACAP±H-89治疗的神经元。对于每个细胞，TTX敏感性Ca的程度2+变化计算为平均值[Ca2+]TTX治疗前后。对于每种情况，在六个独立的实验中分析了60个细胞(*第页< 0.05). （e） 控制和PACAP处理的皮层神经元的全细胞电压灯记录的示例轨迹。PACAP导致爆发样活性增加，与Ca一致2+成像数据。（f） 钙2+急性PACAP治疗的影像学是六个独立实验的代表性样本。
图2
图2
PACAP促进对依赖于AP放电的凋亡刺激的抵抗。（a，b）PACAP保护葡萄孢菌素诱导的细胞死亡，但在TTX存在时不保护。在用100 nM staurosporine治疗前24小时和1小时，在有或无TTX的情况下用PACAP治疗神经元。再过24小时，将细胞固定，DAPI染色，并通过计数致密核和非致密核来测量死亡(*第页< 0.05,n个= 4); （b） 显示了示例图片。（c） PACAP诱导的AP放电可防止营养剥夺，并促进长期神经保护。在t吨=0时，将神经元置于营养培养基中，并给予上图（1-3）中概述的三种治疗方案之一。在t吨=72 h，固定细胞，DAPI染色并分析神经元死亡水平(*第页< 0.05,n个= 3).
图3
图3
PACAP诱导CRE依赖性基因表达，该基因具有神经保护作用，并依赖于AP放电上部-PACAP诱导CRE介导的基因表达。用CRE-萤火虫荧光素酶载体、pTK肾小球转染对照和编码ICER1或对照（β-珠蛋白）的载体转染神经元。有关使用的确切数量，请参阅“方法”部分。在转染后24小时，用PACAP处理神经元，并在进一步4小时后测量荧光素酶的表达。CRE-萤火荧光素酶活性正常化为Renilla对照(*第页< 0.05,n个= 3).下部-PACAP拮抗剂（Antag，PACAP6–38，1μM）对PACAP诱导CRE-淀粉酶的影响(*第页< 0.05,n个= 3). （b） PACAP介导的长期神经保护依赖于CRE介导的基因表达的激活。上图展示了实验方案。简言之，表达GFP的神经元加上ICER1或β-珠蛋白对照组在转染后24小时接受±PACAP处理，然后在24小时后将所有细胞置于含TTX的培养基中，在该培养基上拍摄表达GFP神经元的图像(t吨=上部示意图中的0）。然后在更换培养基后24和48小时监测这些细胞的命运。在三个独立的实验中，对六种培养物中每个处理的250–400个细胞进行了分析。(*第页< 0.05). （c） PACAP诱导的CRE依赖性基因表达依赖于AP放电；所有其他药物均提前1小时添加(*第页< 0.05,#第页对于特定的PACAP/TTX条件，H-89与对照组相比<0.05，n个= 7). （d） PACAP和forskolin诱导的CRE介导的基因表达激活在RIIβ缺陷神经元中被破坏：AP启动依赖和独立成分。在5μM的浓度下使用福斯考林。用于比较的是RIIβ的图解-独立通过GABA治疗通过网络去抑制促进AP放电触发CRE激活A类受体阻滞剂荷包牡丹碱（50μM）加250μM 4-氨基吡啶，这是一种诱导AP放电的非PKA依赖性方式（罂粟碱等。2005) (*第页< 0.05,n个= 6).
图4
图4
PACAP介导的丝氨酸-133 CREB磷酸化诱导不需要AP激发。（a–c）PACAP以TTX不敏感、PKA依赖的方式诱导丝氨酸-133CREB的磷酸化。神经元预先用TTX或H-89治疗，然后用PACAP治疗15分钟。采集蛋白质并进行磷酸化CREB的西方分析（见方法，在所有情况下归一化为总CREB*第页< 0.05,n个=4，显示了示例斑点）。（a） 和（b）显示示例western和（c）显示磷酸化CREB水平的定量（归一化为总CREB）。
图5
图5
PACAP诱导CRTC1的核转位，这是CREB激活的AP点火依赖成分所必需的。（a） CRTC1显性阴性抑制PACAP介导的CREB激活。用CRE-核糖核酸酶、pTK-线虫和编码CRTC1显性阴性突变或对照（β-珠蛋白）的载体转染神经元。神经元受到PACAP或荷包牡丹碱加4-AP（BiC）刺激(*第页< 0.05,n个= 4).(b、 c）PACAP介导的长期神经保护依赖于CRTC1。实验协议与图3（b）中的示意图相同。简言之，表达GFP的神经元加上CRTC1-DN（显性阴性）或β-珠蛋白对照组在转染后24小时接受±PACAP处理，然后在24小时后将所有细胞放置在含TTX的培养基中，在此点拍摄GFP表达神经元的图像。然后在更换培养基后24和48小时监测这些细胞的命运(*第页<0.05，成对T型-测试，n个= 3; #第页<0.05，成对T型-在每个条件/时间点内将控制与PACAP进行测试比较）。（c） 显示了示例图片。比例尺=20μm。（d，e）PACAP通过活性依赖性钙调神经磷酸酶信号传导诱导CRTC1核移位。用编码GFP标记的CRTC1的载体转染神经元。转染后24小时，用20 ng/mL钩体霉素B处理神经元30分钟，以阻止核输出[使输入能更清楚地观察到（Kovacs等。2007年）]，加上指示的抑制剂（1μM TTX、10μM H-89或10μM FK-506），然后在固定细胞之前添加PACAP 30分钟，并分析每次处理400–800个细胞中GFP-CRTC1的定位(*第页< 0.05,n个= 4–8). （e） 显示了示例图片。（f） PACAP诱导CRE介导的基因表达激活需要钙2+-依赖性磷酸酶钙调神经磷酸酶。使用时，在PACAP刺激前1小时添加FK-506(*第页< 0.05,n个= 4). （g） CRTC1过表达可缓解TTX对PACAP介导的CRE激活的抑制。用CRE-核糖核酸酶、pTK-线虫和编码CRTC1或β-珠蛋白对照的载体转染神经元。转染后24小时，用PACAP±TTX或荷包牡丹碱+4-AP（BiC）刺激神经元。CRTC1的过度表达并没有进一步增强BiC或PACAP对CRE的激活，这表明CRE的水平并没有限制，然而，在TTX存在的情况下，CRTC1会强烈增强PACAP诱导的水平(*第页< 0.05,n个= 4).
图6
图6
活性依赖性钙的作用示意图2+PACAP介导的神经保护中的信号转导。PACAP受体的激活通过经典的G蛋白腺苷酸环化酶（AC）-cAMP：途径（1）激活PKA。PKA激活导致突触强度和/或神经元兴奋性增加，导致动作电位放电水平强烈增加，进而触发细胞内Ca2+内流，可能通过突触受体（如NMDA受体）或电压门控钙2+通道（VGCC）：途径（2）。PACAP激活长期神经保护需要转录因子CREB介导的基因表达诱导。丝氨酸-133上的CREB磷酸化可由PKA以AP触发依赖性方式直接触发：途径（3）。然而，这不足以完全激活CREB介导的基因表达。A键Ca2+/活性依赖性途径通过激活钙而涉及CRTC1核移位2+-依赖性磷酸酶钙调神经磷酸酶：途径（4）。蓝色箭头和分子表示AP放电活动无关的事件，而红色箭头和分子突出显示依赖AP放电的事件。本研究中使用的各种途径的药理和遗传抑制剂以绿色显示。
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