miR-200a regulates SIRT1 expression and epithelial to mesenchymal transition (EMT)-like transformation in mammary epithelial cells

doi:10.1074/jbc.M111.229401

.2011年7月22日；286(29):25992-6002.

doi:10.1074/jbc。M111.229401。 Epub 2011年5月19日。

miR-200a调节乳腺上皮细胞中SIRT1的表达和上皮-间充质转化（EMT）样转化

加布里埃尔·伊德斯¹, 袁瑶, 杨慕华, 张永舒, 萨兰亚·楚姆斯里, 群周

附属公司

PMID： 21596753
预防性维修识别码： PMC3138315型
内政部： 10.1074/jbc。M111.229401号

miR-200a调节乳腺上皮细胞中SIRT1的表达和上皮-间充质转化（EMT）样转化

加布里埃尔·伊德斯等人。生物化学杂志. 2011.

.2011年7月22日；286(29):25992-6002.

doi:10.1074/jbc。M111.229401。 Epub 2011年5月19日。

作者

加布里埃尔·伊德斯¹, 袁瑶, 杨慕华, 张永舒, 萨兰亚·楚姆斯里, 群周

附属

¹美国马里兰州巴尔的摩市马里兰大学医学院生物化学和分子生物学系，邮编：21201。

PMID： 21596753
预防性维修识别码： PMC3138315型
内政部： 10.1074/jbc。M111.229401号

摘要

证据支持微RNA（miRNAs）在调节组织特异性分化和发育中发挥关键作用。与健康组织相比，表达谱分析揭示了肿瘤中广泛存在的miRNA失调，这意味着这些程序的中断。miR-200家族已被确定为上皮表型的关键调节因子，因此，它在乳腺癌的上皮-间充质转化（EMT）过程中发挥着重要作用。然而，miR-200家族对正常乳腺上皮细胞转化的影响尚未完全确定。通过检测TGF-β驱动的正常乳腺上皮细胞转化模型，我们证明III类组蛋白去乙酰化酶沉默信息调节器1（SIRT1）是乳腺癌中的一个癌基因，在EMT-like转化中过度表达，miR-200a的表观遗传沉默至少部分导致SIRT1的过度表达。我们通过miR-200a靶向SIRT1 3'-UTR，将SIRT1转录物确定为受miR-200b调控。我们还观察到SIRT1和miR-200a参与了负反馈调节环。miR-200a的恢复或SIRT1的敲除阻止了正常乳腺上皮细胞的转化，表现为凤尾鱼非依赖性生长减少和细胞迁移减少。最后，我们观察到乳腺癌患者样本中SIRT1过度表达与miR-200a降低相关。这些观察结果为miR-200家族在乳腺上皮中的关键抑癌作用提供了进一步证据，此外还发现了一种新的调节机制，可能有助于SIRT1在乳腺癌中的上调。

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数字

**图1。**
**乳腺上皮细胞的转化与SIRT1和miRNA表达的改变有关。** 一形态的改变与转化有关。典型图像显示了从正常HME到HME-T的形态学变化（永生化并用10 ng/ml TGF-β1治疗21天）。*比例尺*，100微米。B类，SIRT1蛋白水平在转化后过度表达。Western blot比较正常细胞（HME）和转化细胞（HME-T）的蛋白质水平。3个独立实验的代表性结果。C类，变换与miRNA表达的改变有关。来自miRNA qRT-PCR阵列的结果，比较了转化前后88个miRNA。散点图值表示细胞系间miRNA折叠变化，对数₁₀(2^-ΔCt). 这个*暗中线*代表细胞系之间的稳定表达，外系代表转化细胞中miRNA表达上调或下调的4倍截止。表中列出了上调或下调4倍或以上的miRNA。

**图2。**
**miR-200a的表观遗传沉默与转化相关。** 一，miR-200a/miR-141在转化过程中丢失。qRT-PCR比较正常和转化HME细胞之间miR-200a和miR-141的结果，以及比较非肿瘤性MCF-10A乳腺上皮细胞和乳腺癌细胞系MDA-MB-231的结果(n个=3±S.E）。B类miR-200a启动子区和编码区CpG岛的甲基化水平。清空和*填充椭圆*分别表示未甲基化胞嘧啶和甲基化胞苷。启动子区CpG位于第1染色体上的核苷酸370633至370819（链（+），RefSeq登录号AC_000133.1）。编码区CpG位于第1染色体上的核苷酸374693至374845（链（+），RefSeq登录号AC_000133.1）。这个*实心矩形*表示mir-200a相对于测序结果的编码区域。箭头表示miR-200B/A/429在第1染色体上的相对位置。显示了五个克隆的测序结果和甲基化CpG的平均百分比。

**图3。**
**表观遗传治疗可恢复转化细胞中miR-200a和miR-141的水平。** 一SAHA或Aza治疗可恢复转化细胞中miR-200a的表达。24小时SAHA后miR-200a水平（10μ米)或96小时Aza（5μ米)转化细胞和MDA-MB-231细胞的处理。平均值±S.E(n个= 3).B类，miR-141在转化细胞中的治疗性修复。24小时SAHA后miR-141水平（10μ米)或96小时Aza（5μ米)转化细胞和MDA-MB-231的处理。平均值±S.E(n个= 3).C类miR-200a启动子区组蛋白乙酰化水平。miR-200a启动子区ChIP的结果。用乙酰化组蛋白H3（Ac-H3）免疫沉淀交叉连接的超声染色质(n个=2），乙酰化组蛋白H4（Ac-H4）(n个=3），或SAHA治疗24小时前后的IgG控制抗体（10μ米). 通过实时qRT-PCR（平均值±S.E.）评估miR-200a启动子的组蛋白乙酰化状态。

**图4。**
**SIRT1是miR-200a调控的新靶点。** 一，SIRT 3′-UTR以及miR-200a和miR-141的种子序列的图示，显示了SIRT1 mRNA的3′-UTR上的计算预测的靶区。B类，miR-200a降低SIRT1 3′-UTR荧光素酶活性。用2μg含有SIRT1 3′-UTR或SIRT1 MUT 3′-UTR的pGL3萤光素酶载体转染HEK293T细胞（在miRNA响应元件中具有A-to-g突变）。细胞与50 n米miR-200a前体24小时，然后裂解并评估荧光素酶活性。平均值±S.E(n个= 3).C类、将SIRT1 mRNA水平归一化为GAPDH mRNA的qRT-PCR结果。正常细胞和转化细胞中SIRT1的mRNA水平(*左侧面板*). 转染50 n的转化细胞中SIRT1 mRNA的水平米miR-200a前体72小时(*中间面板*). 24小时SAHA后SIRT1 mRNA水平（10μ米)或96小时Aza（5μ米)转化细胞的治疗(*右侧面板*). 平均值±S.E(n个= 3).D类SIRT1蛋白水平的Western blotting。转染50 n的HEK293T细胞中SIRT1水平米miR-200a前体48小时(左边;n个= 3). 转染50 n的转化细胞中SIRT1水平米miR-200前体(中心;n个=2），或与50 n共转染的HEK293T细胞米miR-200a和2μg FLAG-tagged SIRT结构缺乏3′-UTR(*正确的*;n个= 3).A–C,第页值由双面未配对确定t吨测试。*，第页< 0.05.续。，控制。

**图5。**
**SIRT1对miR-200a表达的调节。** 一，miR-200a启动子荧光素酶报告子的SIRT1调节。用miR-200a启动子报告子（2μg）（−1574至+120）和*雷尼利亚*荧光素酶控制48h后，对细胞进行裂解，并对荧光素素酶活性进行评估。平均值±S.E(n个= 3).B类，改变了miR-200a启动子的SIRT1招募。使用SIRT1、DNMT1、DNMT 3A和DNMT3B抗体IP后miR-200a启动子的ChIP实验的实时qRT-PCR结果。平均值±S.E(n个= 3).一和B类,第页值由双面未配对确定t吨测试。*，第页< 0.05.

**图6。**
**miR-200a对SIRT1的调节影响转化诱导的锚定非依赖性生长和侵袭。** 一通过添加miR-200a或抑制SIRT1逆转转化相关形态学。正常HME细胞、HME-T转化细胞、转染50 n的HME-T转换细胞的代表性图像米miR-200a前体细胞和转染shRNA抗SIRT1的HME-T转化细胞72小时。*比例尺*，100微米。B类软琼脂试验中细胞集落形成。HME-T细胞转染50 n米miR-200a前体或SIRT1 shRNA.10⁴每个细胞系的细胞接种在六孔板的每个孔中。3周后，菌落被结晶紫染色。通过四个随机域（10×目标）的平均菌落数，对三个独立实验的平均值±S.E.进行定量分析。*比例尺*，100微米。C类，miR-200a/shSIRT1抑制转化诱导的细胞迁移。使用孔径为8-μm且涂有Matrigel的Transwell。HME-T细胞转染50 n米miR-200a前体或shRNA靶向SIRT1 48小时0.5×10⁵每个细胞系的细胞用于隔夜迁移。迁移的细胞被结晶紫染色。通过四个随机场（10×目标）的平均迁移细胞数进行分析，两个独立实验的平均值±S.E。*比例尺*，100微米。星号指示重要性，第页由双面未配对确定的值t吨测试。***，第页< 0.001.

**图7。**
**一，SIRT1敲除可以恢复E-cadherin的表达。**SIRT1干扰对照或shRNA转染HME-T细胞的Western blot(n个= 2).B类E-cadherin mRNA的qRT-PCR结果归一化为GAPDH。HME-T（转化）或HME（对照）细胞中E-cadherin的表达(n个= 2).C类，改变了SIRT1对E-钙粘蛋白的募集(*CDH1型*)启动子。ChIP实验的实时qRT-PCR结果*CDH1型*启动子与SIRT1和DNMT3B抗体免疫沉淀。平均值±S.E(n个= 2).D类，甲基化状态*CDH1型*发起人。甲基化特异性PCR结果*CDH1型*HME-T（转化）和HME-C（对照）细胞中的启动子。产品尺寸如下：未甲基化(U型)97个基点；甲基化的(*M（M）*)，116个基点(n个= 2).B类和C类,第页由双面未配对确定的值t吨测试。*，第页< 0.05.

**图8。**
**乳腺癌患者样本中SIRT1升高与miR-200a下调相关。** 一SIRT1在乳腺癌患者样本中过度表达。DCIS和IDC患者及正常乳腺组织SIRT1的免疫组织化学染色(n个= 5). 苏木精用于细胞核可视化。使用3,3-二氨基联苯胺证明SIRT1染色。对细胞核染色阳性的乳腺上皮细胞百分比进行量化（平均值±S.D.）。*比例尺*，60微米。B类，miR-200a水平在乳腺癌患者样本中降低。qRT-PCR测量五个DCIS和五个IDC患者样本相对于健康乳腺上皮组织的miR-200a的结果。结果归一化为snRNA U6水平。C类，乳腺癌患者血液中的MiR-200a/MiR-141水平降低。定量RT-PCR检测DCIS中miR-200a和miR-141水平的结果(n个=2）和IDC(n个=4）相对于对照患者血液，患者采集全血。结果被归一化为snRNA U6水平。一和B类,第页由双面未配对确定的值t吨测试。*，第页< 0.05.

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