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.2011年7月；301（1）：G110-8。
doi:10.1152/ajpgi.00412.2010。 Epub 2011年4月28日。

肝星状细胞需要一个僵硬的环境来分化成肌纤维细胞

艾比·奥尔森 1, 史蒂文·布鲁默, 埃里克·P·陈, 玛丽安娜·达加萨, 佩内洛普·乔治斯, 布里吉特·萨基, 植村正之, 保罗·A·詹美, 丽贝卡·G·威尔斯
附属公司

肝星状细胞需要一个僵硬的环境来分化成肌纤维细胞

艾比·奥尔森等。 美国生理学杂志胃肠测试肝脏生理学. 2011年7月.

摘要

肝星状细胞（HSC）的肌成纤维细胞分化是肝纤维化的关键事件，也是各种原因导致慢性肝病肝硬化的最终常见途径的一部分。驱动HSC分化的分子机制尚不完全清楚。由于宏观组织硬化是纤维化疾病的一个特征，我们假设基础基质的机械特性是HSC激活的主要决定因素。原代大鼠HSC培养在惰性聚丙烯酰胺支架上，该支架具有可变但精确定义的剪切模量（刚度），涂层有不同的细胞外基质蛋白或聚赖氨酸。通过细胞形态学、免疫荧光染色和基因表达测定HSC分化。随着所有涂层基质（包括Matrigel）上基质硬度的增加，HSC逐渐变为肌纤维母细胞。HSC激活的程度而不是速度与底物硬度相关，在中等硬度的支架上培养的细胞采用稳定的中间表型。软支架上的静止细胞在接触硬支架时能够进行肌纤维母细胞分化。硬度依赖性分化需要粘附基质蛋白并产生机械张力。转化生长因子-β处理增强了刚性支架上的分化，但不是必需的。HSC在体外分化为肌成纤维细胞主要取决于基质的物理特性而非化学特性。HSC需要具有机械硬度的底物，与基质蛋白粘附并产生机械张力，才能进行分化。这些发现表明，肝脏硬度的改变是驱动纤维化进展的关键因素。

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图1。
图1。
肝星状细胞（HSC）在较硬的基质上扩张和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达增加。A类：新鲜分离的大鼠HSC在不同剪切模量（G′）的I型胶原涂层聚丙烯酰胺凝胶上培养7天，范围为0.4至12 kPa。通过光学显微镜观察，HSC在软支架（0.4–1.0 kPa）上表现为形态静止。这些细胞还显示出紫外自荧光（数据未显示）。在坚硬（8–12 kPa）聚丙烯酰胺支架上镀HSC显示出激活的肌纤维母细胞样表型。在中间载体（1.75–2.5 kPa）上培养的HSC表现为中间表型。这些结果代表了3个实验。棒材，50μm。B类：HSC培养方式如下A类并用油红O（ORO）染色，用4,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI；蓝色）复染。硬性凝胶上的脂滴减少。代表性细胞来自2个不同的实验Bar，50μM。C类：HSC培养方式如下A类并用大鼠星状细胞标志物结蛋白（红色）和α-SMA（绿色）抗体进行免疫染色；细胞核用DAPI（蓝色）染色。硬凝胶上的细胞结蛋白表达减少，而α-SMA表达和细胞大小增加。α-SMA组织在12-kPa凝胶上的细胞应力纤维中。照片代表了3个实验（条形，10μm，注意不同的放大倍数）。D类：HSC培养方式如下A类，并对I型胶原和III型胶原进行定量RT-PCR（qRT-PCR）。将结果归一化为18s rRNA的表达，并从3-4个独立实验中取平均值，每个实验一式三份。数值为平均值±SE**P（P）< 0.01. ***P（P）< 0.005.E类：原代造血干细胞在硬度为0.4-kPa的I型胶原包被的聚丙烯酰胺凝胶上培养8天（d8），维持静止表型(左边). 在相同条件下再培养3天的细胞外观保持静止(中间的)而凝胶上覆盖有玻璃盖玻片的区域的细胞在额外的3天内开始扩散并失去脂滴(正确的). 代表性细胞来自2个独立实验；×40倍放大。
图2。
图2。
HSC在坚硬的基质上进行成肌纤维细胞分化，与基质涂层无关。A类：HSC在不同硬度的聚丙烯酰胺凝胶上培养7天，聚丙烯酰胺凝胶涂有I型胶原、血浆纤维连接蛋白或基质。无论细胞外基质（ECM）涂层如何，HSC在刚性（12 kPa）支架上采用肌纤维母细胞表型，在柔性（0.4 kPa）支架下保持静止。结果代表了至少3个实验。棒材，50μm。B类：使用Image J软件追踪不同基质和支架上的细胞，以量化周长(左边)和面积(正确的). 数值为平均值±标准偏差Mg，Matrigel；I型胶原；Fn，血浆纤维连接蛋白。对每种情况下至少40个细胞进行分析。
图3。
图3。
随着时间的推移，越来越硬的底物上的基因表达变化与塑料上的变化类似。A类：原代HSC在组织培养塑料上培养，并于第1天（静止表型），第4天（中间），以及第7天（肌纤维母细胞）。用qRT-PCR检测四个基因[β-actin、α-SMA、PDGF受体-β（PDGF-Rβ）和过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）]的mRNA表达，并将其归一化为18S rRNA内部对照。基因表达的变化与第1天.本实验一式两份，两个独立的HSC分离株(n个=总共4个重复）。B类和C类：原发性HSC在可变刚度的聚丙烯酰胺支架上培养7天，涂有0.1 mg/ml I型胶原(B类)或0.2mg/ml血浆纤连蛋白(C类). 同一组基因的mRNA表达通过qRT-PCR测定，每个点的表达水平与软支撑（0.4 kPa）的表达水平相关。随着聚丙烯酰胺载体硬度的增加，HSC基因表达的变化与观察到的HSC逐渐激活的变化平行。每次实验(B类和C类)用3个独立的细胞分离物重复进行(n个=总计6）。数值为平均值±标准差。
图4。
图4。
即使在缺乏转化生长因子（TGF）-β的情况下，刚性基质上的HSC也表达α-SMA。原代大鼠HSC培养在2.5或12 kPa的I型胶原涂层聚丙烯酰胺底物上。A类：从分离后的第二天开始，在细胞粘附到凝胶上后，用100 pM TGF-β载体对其进行处理1，5μM TGF-β激酶抑制剂（NPC-34016；抑制剂1），或TGF-？和激酶抑制剂的组合。7天后，细胞固定并用抗α-SMA抗体染色（红色）。细胞核用DAPI染色（蓝色）。×20放大倍数。B类和C类：细胞被视为A类，但使用不同的激酶抑制剂（616451；抑制剂2）或pan-TGF-β阻断抗体（αTGF-β）。细胞染色如A类结果代表了两个独立实验。对照组用载体和小鼠血清IgG进行治疗。D类：使用美国国立卫生研究院图像J计算细胞面积。结果是两个独立实验的代表。数值为平均值±标准偏差。#与车辆显著不同，P（P）< 0.05. *与TGF-β治疗显著不同，P（P）< 0.05. **与TGF-β治疗显著不同，P（P）< 0.01.E类：原代大鼠HSC培养在刚度为0.4kPa的I型胶原涂层聚丙烯酰胺基质上。从分离后的第二天开始，在细胞粘附到凝胶上后，用载体或100 pM TGF-β对其进行处理17天后，细胞固定并用抗α-SMA抗体染色（红色）。细胞核用DAPI染色（蓝色）。×20放大倍数。F类和G公司：细胞被视为B类，然后通过实时PCR分析α-SMA的表达(F类)和I型胶原蛋白(G公司). 数值为平均值±SE。
图5。
图5。
HSC需要基质-蛋白质相互作用才能在刚性支架上进行肌纤维母细胞分化。A类：原代大鼠HSC培养在涂有0.1 mg/ml聚乙烯的12-kPa聚丙烯酰胺支架上-我-赖氨酸（PLL）最多可维持8天。即使在第8天，细胞扩散最小，并保留维生素A液滴（亮场）。照片代表了4个实验中的细胞。×10放大倍数。B类：原代大鼠HSC在0.1 mg/ml PLL、0.05 mg/ml PLL+0.05 mg/ml I型胶原或血浆纤维连接蛋白的混合物或0.1 mg/ml胶原或血浆纤维连接蛋白单独培养7天。ORO染色显示PLL上细胞内脂滴滞留，但随着基质蛋白数量的增加，脂滴的扩散和损失增加。×20放大倍数。C类：中细胞面积的量化B类其中ECM代表胶原蛋白或纤维连接蛋白。用图像J追踪细胞（每个数据点15–32个）以确定面积，数据显示为平均值±SD。双向方差分析显示PLL和PLL/ECM点与单独PLL相比具有统计学意义P（P）< 0.0001.
图6。
图6。
HSC需要产生机械张力，以便在刚性支架上进行肌纤维母细胞分化。原代大鼠HSC在特氟隆支架上培养7天。A类：细胞核用DAPI染色（蓝色）。B类：用紫外自荧光法观察含维生素A的脂滴。×20放大倍数。C类和D类：通过冲洗从聚四氟乙烯中轻轻取出如上处理的细胞，并将其重新放置在玻璃上。C类：6小时后，ORO染色的细胞显示出持续的脂滴。×60放大倍数。D类：细胞在玻璃上培养5天（在特氟隆上培养7天后），然后用α-SMA抗体染色（红色），显示应力纤维中存在α-SMA。×20放大倍数。ORO和免疫染色是3个独立实验的代表。
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