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.2011年5月10日；108(19):7769-74.
doi:10.1073/pnas.1016472108。 Epub 2011年4月25日。

Barkor/Atg14（L）自噬体靶向和膜曲率传感

微凉扇 1, 阿什利·纳西里, 清忠
附属公司

Barkor/Atg14（L）自噬体靶向和膜曲率传感

魏良凡等。 美国国家科学院程序. .

摘要

III类磷脂酰肌醇3-激酶（PI3KC3）对自噬体的生物发生至关重要。长期以来，人们推测自噬体膜成核，但这种成核活性的生化机制仍未解决。我们最近确定Barkor/Atg14（L）为PI3KC3对自噬体膜的靶向因子。在这里，我们已经表征了自噬体靶向所需的Barkor/Atg14（L）区域，并鉴定了位于Barkor羧基末端的BATS[Barkor/Atg14（L）自噬体靶向序列]结构域。生物信息学和突变分析表明，BATS结构域通过内源性两亲性α螺旋的疏水表面与自噬体膜结合。BATS punta以应力诱导的方式与Atg16和LC3重叠，部分与DFCP1重叠。外源性表达的BATS积聚在高度弯曲的小管上，可能代表中间自噬结构。Barkor/Atg14（L）的PI3KC3招募和自噬刺激需要BATS域。此外，我们的生化分析表明，BATS结构域直接与膜结合，有利于由磷脂酰肌醇3-磷酸[PtdIns（3）P]和磷脂酰肌糖4,5-二磷酸[PtdIns（4,5）P2]组成的膜。通过优先结合与PtdIns（3）P（而非PtdIns（4,5）P2）结合的弯曲膜，BATS域能够感应膜的曲率。因此，我们提出了一种新的PI3KC3自噬体膜成核模型，其自噬小体特异性接合器Barkor通过BATS结构域在高度弯曲的富含PtdIns（3）P的自噬膜上聚集，以感知和维持膜的弯曲。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
识别自噬体靶向和自噬激活所需的BATS结构域。(A类). Barkor缺失突变体的示意图。所有突变体都用hrGFP和FLAG标记。自噬体定位被定义为在CQ处理时与LC3重叠的胞质点状。(B类). 用hrGFP标记的各种Barkor/Atg14（L）片段转染稳定表达Myc-LC3的细胞。用200μM CQ处理细胞2 h，并用LC3抗c-Myc抗体和Barkor/Atg14（L）突变体的绿色荧光染色。(C类). U型2过度表达全长Barkor、BarkorΔ10aa和U的OS细胞2使用透射电子显微镜观察OS亲代细胞。AV用黑色箭头标记。比例尺，2μm。(D类). 计算每个横截面的AVs（对照组，3.45±0.35；Barkor/Atg14（L）Δ10aa，3.5±0.32；Barkor/Atg14（L）重量：12.6±0.9）。(电子). 在所述细胞中检测到LC3和微管蛋白C类; 用50 nM Bafilomycin处理2小时以阻止溶酶体降解。
图2。
图2。
BATS的两亲性α螺旋负责自噬体膜结合。(A类). 对脊椎动物Barkor/Atg14（L）同源物的最后80个氨基酸（BATS）进行了比对，并用方框预测和标注了高度保守的膜相互作用螺旋。(B类). 预测的膜相互作用螺旋呈现为两亲性螺旋轮。疏水残基为黄色，亲水残基为蓝色，带正电残基为绿色。三个疏水性残基在C类用箭头标记。(C类). 稳定表达Myc-LC3的细胞与不同的BATS突变体共表达，这些突变体被hrGFP标记（BATS K486A、R492A和BATS WFYm-BATS突变型W484R、F485R、Y488R）。用200μM CQ处理细胞2h，并用LC3的c-Myc抗体和BATS突变体的绿色荧光染色。(D类). U型2OS细胞与Myc-Beclin 1和不同的Barkor/Atg14（L）突变体共表达，用hrGFP标记，并用200μM CQ处理(电子). 稳定表达Myc-LC3的细胞与GFP-Beclin 1或GFP-Beclin 1-BATS共表达，并用200μM CQ处理2 h。
图3。
图3。
BATS定位于高度弯曲的早期自噬结构。(A类). U型2用hrGFP-BATS和Myc-DFCP1转染OS细胞。转染后48小时，用EBSS处理细胞1小时，或用200μM CQ处理细胞2小时；Myc-DFCP1用罗丹明红抗体染色，激光共聚焦显微镜检测。(B类)U型2用hrGFP-BATS和Myc-Atg16转染OS细胞。转染后48小时，用EBSS处理细胞1小时或用2μM雷帕霉素处理细胞4小时；用罗丹明红抗体对Myc-Atg16进行染色，并用激光共聚焦显微镜进行检测。(C类和D类)U型2表达GFP标记BATS的OS细胞（转染后2天）用EBSS培养基处理，并在荧光显微镜下观察。添加EBSS培养基后立即拍摄图像(C类)或在30分钟的时间点(D类)（另请参见电影S1). 箭头标记管子。(电子). 饥饿后，沿着时间进程（0–30分钟）的箭头标记出一个具有代表性的小管。(F类). U型2加入EBSS培养基后捕获表达GFP-BATS和番茄-LC3的OS细胞；每2秒捕获一次两个通道。展示了两幅具有代表性的图像（另请参见电影S2). 箭头标记小管。
图4。
图4。
BATS结构域的膜结合活性。(A类). GST标记的野生型BATS、BATS WFYm突变体、嗜内素1和PLCδ的PH结构域的构建物从大肠杆菌从杆状病毒感染的昆虫细胞中表达并纯化全长His-tagged Barkor/Atg14（L）。(B类). 中描述的纯化重组蛋白A类在共沉淀试验中测试其脂质体结合活性。本试验使用了从牛脑脑提取物的Folch组分I中生成的脂质体。S表示上清液，P表示颗粒。结合效率计算为结合蛋白（P）与输入（P+S）。(C类). 重组野生型BATS、BATS WFYm突变体和PLCδ的PH域与不同形式的磷脂酰肌醇结合的脂质体孵育，并在共沉淀试验中测试其脂质体结合。S表示上清液，P表示颗粒。(D类). 表达GFP-BATS和Myc-LC3的细胞未经处理，仅用雷帕霉素或与3-甲基腺嘌呤（3-MA）联合处理，并在荧光显微镜下观察。从三个独立的实验中计算出至少50个细胞的每个细胞点数。
图5。
图5。
BATS域的膜曲率传感。(A类). 在共沉淀试验中，将不同粒径（100–800 nm）的Folch分数衍生脂质体与重组BATS孵育。S表示上清液，P表示颗粒。(B类). 脂质体结合被评估为BATS与脂质体结合的百分比，而BATS与800nm脂质体的结合百分比。通过测量脂质体中荧光标记的PE来评估脂质体的载量。(C类). 将等量PC、PE与PtdIns（3）P（0.2、0.6、2和6 mol%）的梯度增加比例相结合的350微摩尔脂质体制成两种不同尺寸（100和800 nm）的脂质体，并通过共沉淀法检测其与重组BATS的结合。S表示上清液，P表示颗粒。结合效率（结合蛋白与输入）表示为P/（P+S）。(D类). 中描述的类似脂质体结合试验(C类)使用PtdIn（4，5）P2进行。(电子). 提出了Barkor/Atg14（L）BATS结构域在高弯曲PtdIns（3）P富集膜上靶向Barkor/Attg14（L）的功能模型。N、 N终点；C、 C终点。请参阅文本了解更多说明。
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