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.2011年6月10日；286(23):20710-26.
doi:10.1074/jbc。M110.213538。 Epub 2011年4月13日。

帕金森病相关蛋白α-突触核蛋白直接促进线粒体分裂

Ken Nakamura（中村） 1, Venu M Nemani公司, Farnaz Azarbal公司, 盖亚·斯基宾斯基, 乔恩·M·利维, 清道真美（Kiyoshi Egami）, 拉里萨·穆尼什基纳, 觉章, 布鲁克·加德纳, Wakabayashi君子, Hiromi Sesaki先生, 程一凡, 史蒂文·芬克贝纳, 罗伯特·L·努斯鲍姆, 埃利泽·马西利亚, 罗伯特·爱德华兹
附属公司

帕金森病相关蛋白α-突触核蛋白直接促进线粒体分裂

Ken Nakamura（中村）等。 生物化学杂志. .

摘要

蛋白α-突触核蛋白在帕金森病中起着核心作用，但其导致神经退行性变的机制尚不清楚。我们现在发现，哺乳动物细胞（包括体外和体内神经元）中α-synuclein的表达会导致线粒体的断裂。这种效应对synuclein是特异性的，α-亚型的断裂比β-或γ-亚型多，并且不伴有其他细胞器形态或线粒体膜电位的改变。然而，线粒体断裂最终导致呼吸下降和神经元死亡。断裂不需要线粒体裂变蛋白Drp1，并且涉及到同核蛋白与线粒体膜的直接相互作用。在体外，突触核蛋白会破坏含有线粒体脂质心磷脂的人造膜，这种作用对突触核素的小寡聚体形式是特异的。因此，α-突触核蛋白对长期参与帕金森病发病机制的细胞器的形态产生主要和直接的影响。

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数字

图1。
图1。
突触核蛋白在HeLa细胞中产生线粒体断裂。 A类和B类，HeLa细胞与编码天青蛋白（鉴定转染细胞）、有丝分裂生长因子（鉴定线粒体）以及空载体对照、CFP、野生型α-突触核蛋白的cDNA共转染(同步器)、A30P、A53T或E46Kα-突触核蛋白。转染48h后，根据蓝铜矿荧光和成像活性筛选细胞；图像是随机的，线粒体形态被分为片段、管状或中间盲转染基因型。比例尺表示10μm。这个条形图(B类)显示每组中的细胞百分比。野生型A53T和E46Kα-突触核蛋白产生线粒体断裂，在对照组中未观察到(反对的论点)、CFP、A30P和T6K（用赖氨酸替换Thr-22、Thr-33、Thr-44、Thr-59、Thr-81和Thr-92）突触核蛋白，第页<0.0001（χ）2分析。n个=每组33–41个细胞，来自两个独立的转染。C类对上述转染细胞进行α-synuclein的固定和免疫染色，对具有一系列synuclein水平（不考虑线粒体形态选择）的细胞进行线粒体形态成像和分类。每组中的单元格数量如所示圆括号。D类和E类α-、β-和γ-突触核蛋白对线粒体形态的影响在活HeLa细胞和固定细胞中以相同的方式进行评估(E类). α-和β-突触核蛋白产生线粒体断裂(第页<0.0001），而γ-突触核蛋白不(D类).n个=每组39–50个细胞，来自三个独立的转染。F类，将细胞与突触核蛋白和任一siRNA共同转染到人类突触核素（Silencer Select s13204(1)，s13205(2)和s13206(三))或对照siRNA（Silencer Select阴性对照1(反对的论点)). siRNA2和-3（但不是siRNA1或控制siRNA）有效降低同核蛋白表达(补充图S3)阻止线粒体断裂(n个=每组18–27个细胞，来自两个独立的转染，第页< 0.0001).
图2。
图2。
α-突触核蛋白对内质网或高尔基形态没有实质性影响。 A类，HeLa细胞与编码天青蛋白、丝裂原生长因子和任一载体控制（−同步器)或α-突触核蛋白(+同步器). 转染后48h，固定细胞，通过KDEL受体染色鉴定内质网。α-突触核蛋白对内质网的形态没有影响。比例尺表示10μm。B类将稳定表达有丝分裂生长因子P的HeLa细胞与编码蓝铜矿的cDNA和任何一种载体控制（−同步器)或α-突触核蛋白(+同步器). 对照转染的细胞也用5mg/ml布雷费尔德素A处理(博鳌亚洲论坛)成像前60min，冲洗后4h再次成像。转染后48小时，细胞固定并染色高尔基基质蛋白GM130。根据线粒体和高尔基体形态，随机细胞被分类为转染盲细胞。α-突触核蛋白产生线粒体断裂(第页<0.0001），而对照组、BFA和清洗后的BFA则没有。相反，BFA引起高尔基复合体的剧烈碎裂，远远大于同核蛋白引起的碎裂(第页<0.0001），这不会影响线粒体形态。n个=每组24–111个细胞，来自四个独立的转染。
图3。
图3。
线粒体断裂先于线粒体功能或毒性的任何干扰。 A类和B类，HeLa细胞转染有丝分裂生长因子P和空白载体对照(反对的论点)或α-突触核蛋白(+同步器)然后装入膜潜在敏感染料TMRM（1 n米)在现场成像前1小时。根据GFP选择，在单个细胞中定量TMRM荧光。质子离子载体FCCP（2.5μ米)4分钟后，再成像导致TMRM荧光从线粒体明显重新分布(箭头).比例尺表示10μm。TMRM荧光定量(B类)显示synuclein无作用。数值表示平均值±S.E。n个=四次独立转染每种条件下12–49个细胞。C类，用载体控制或α-突触核蛋白转染COS细胞。1-2天后，在基础状态下测量耗氧量（10 m米谷氨酸和2.5米米苹果酸）和添加ATP合成酶抑制剂寡霉素后(寡聚物)（1μg/ml），质子离子载体FCCP（1μ米)和复合I抑制剂鱼藤酮(腐烂)（500牛顿米). 突触核蛋白在48小时（而非24小时）损害基线呼吸，在与FCCP解偶联的线粒体中影响更大，第页< 0.01; **,第页<0.005；***，第页< 0.001;NS公司单因素方差分析和Newman-Keuls事后检验均不显著。n个=每组4-9个实验。D类，COS细胞转染载体控制、α-突触核蛋白或蓝铜矿(天青)16小时后，将其重新放置在96个钢板上。转染后24、48、72和96小时，用钙黄绿-AM（1μ米)用溴化乙锭（5μ米)计数死亡细胞，或70%甲醇后加溴化乙锭计数细胞总数。α-突触核蛋白对细胞24小时的存活也没有影响，而实际上所有细胞都已经发生了分裂(补充图S8B类). 然而，到了48小时，在实验期间持续存在的死亡细胞数量略有增加(第页< 0.01对通过单向方差分析和Newman-Keuls事后检验，在48、72和96小时对对照组和蓝铜矿进行测定）。数据显示平均值±S.E。，n个=每组6口井。
图4。
图4。
突触核蛋白破坏线粒体超微结构。 A–C，COS细胞被转染有丝分裂GFP和载体控制或α-突触核蛋白，并在18 h时进行GFP荧光分选，将处于表达最高四分位的细胞接种到aclar盘上。再培养6小时，将细胞固定在2.5%戊二醛中，并通过电子显微镜进行检查。A类和B类，α-synuclein破坏线粒体超微结构。比例尺表示500 nm。C类，随机收集线粒体，分析线粒体外膜和内膜之间的距离(O-I公司)以及相邻内膜之间(我-我)，数据表示为平均值±S.E。，n个O-I=138–176，I-I=222–335。C类突触核蛋白还增加了至少一次分支的嵴的比例，同时横穿线粒体的直径。酒吧表示平均值±S.E。，n个=每组55–56个嵴，来自两个独立的转染。*，第页经两次单因素方差分析和Newman-Keuls事后检验均<0.01。反对的论点，控制。D–G，超微结构分析显示，6个月龄非转基因小鼠（D)而α-synuclein转基因的线粒体嵴结构紊乱(热重（tg）)小鼠(E类). α-突触核蛋白转基因线粒体的横截面直径也增加(D、 E类、和G公司)和不连续（断裂）的外层膜(F类和G公司).*中，第页<0.01（非配对双尾学生）t吨测试(n个=每组4人）。尺寸条指示0.25μm。H–J6个月未转基因小鼠中脑神经元α-突触核蛋白的免疫电镜观察(H（H）)和α-突触核蛋白转基因(我)小鼠表现出与非转基因线粒体环膜相关的10纳米金颗粒，未经IgG对照标记(J型). 然而，在同核蛋白转基因小鼠中，大多数金颗粒定位于内膜。这个条形图(K（K）)表示金颗粒在线粒体内外膜上的分布。*，第页<0.01（非配对双尾学生）t吨测试(n个=每组4人）。这个尺寸条指示0.5μm。左旋-右旋超微结构分析显示中脑神经元线粒体的形态与对照组无差异对同核蛋白TKO小鼠。这个尺寸bar表示0.5μm。
图5。
图5。
突触核蛋白导致的线粒体分裂先于神经元死亡。用mRFP和α-synuclein转染大鼠海马神经元5天后(同步器)或矢量控制(反对的论点) (A–F)，无或有丝裂原生长因子(A、 E类、和F类). MitoGFP公司(A类)然后每天使用自动显微镜对mRFP（未显示）进行成像。比例尺为10μm。B类，累积死亡风险曲线表明表达synuclein的初级神经元的死亡风险显著高于对照细胞（***，第页<0.0001，对数秩检验）。n个=每组112–115个神经元。实验重复了三次，结果相似。C类，在转染后24小时测量单个神经元的mRFP荧光，并用作突触核蛋白表达的替代物。根据mRFP荧光，神经元被分为三个表达组（低、中、高）。a.u（美国）.，任意荧光单位。在这些组中，突触核蛋白(黑暗的)和控制(光)转染神经元的mRFP荧光无明显差异。D类，累积死亡风险曲线表明神经元表达较高水平的突触核蛋白(红色和蓝色)与表达同等mRFP的对照组相比，其死亡风险具有剂量依赖性。**，第页< 0.005; ***,第页< 0.0001;纳秒，不重要，n个=每组22–46个神经元。E类累积死亡风险曲线显示，线粒体碎片化神经元在48小时内的死亡风险逐渐高于线粒体中间或未碎片化神经元（*，第页<0.05；**，第页< 0.005; ***,第页< 0.001).E类和F类线粒体碎片化的神经元逐渐表达较高水平的突触核蛋白（*，第页< 0.05).
图6。
图6。
突触核蛋白通过不依赖于Drp1的直接相互作用使线粒体碎片化。 A类将永生化的Drp1 KO和对照小鼠胚胎成纤维细胞与编码蓝铜矿（鉴定转染细胞）、丝裂原生长因子（鉴定线粒体）的cDNA以及空白载体对照细胞共同转染(反对的论点)或野生型α-突触核蛋白(同步器). 转染48小时后，根据蓝铜矿荧光和活体成像选择细胞，图像随机化，线粒体形态根据转染基因型分为碎片、管状或中间盲。比例尺表示10μm。这个条形图显示每组中的细胞百分比。在基线，缺乏Drp1的细胞有更多的微管线粒体(第页< 0.0001). 然而，即使在缺乏Drp1的情况下，synuclein也会产生强大的线粒体碎片(第页< 0.0001).n个=每组13–34个细胞，来自两个独立的转染。B类和C类，HeLa细胞与蓝铜矿（鉴定转染细胞）、丝裂原生长因子P（鉴定线粒体）和未标记的α-突触核蛋白共同转染(同步器)或α-突触核蛋白通过与Lyn激酶N-末端肉豆蔻酰化/棕榈酰化信号融合靶向分泌途径(MPsyn（MPsyn）).B类转染后48h，对细胞进行固定和α-synuclein免疫染色，对具有不同synuclein水平（不考虑线粒体形态）的细胞进行线粒体形态成像和分类。每组中的单元格数量如所示圆括号与syn相反，MPsyn即使在高水平表达时也无法使线粒体碎片化。C类，根据蓝铜矿荧光和活体成像选择细胞，图像随机化，线粒体形态根据转染基因型分为片段、管状或中间盲。比例尺表示10μm。这个条形图显示了每组中细胞的百分比。syn片段线粒体(第页<0.0001），而控制和MPsyn没有。n个=每组28–50个来自两个独立转染的细胞。
图7。
图7。
重组寡聚α-突触核蛋白簇人工膜。 A类将含有CL和PC（1:1）或PC单独的人工脂质体与单体和三聚联核蛋白（0.3 mg/ml）或BSA（0.6 mg/ml）的组合，以及与1,2-二油酰基的N末端结合的微量NBD的荧光，在不含蛋白质的情况下孵育5分钟-锡-甘油-3-磷酸胆碱或心磷脂(NBD-CL公司)用光学显微镜观察。比例尺表示10μm。B类脂质体聚集的定量分析。个人表明一个领域中的脂质体基本上都是分离出来的；小型集群每簇显示2–10个脂质体，以及大型集群表示每个簇有10个以上的脂质体。单独含有CL和PC或含有BSA的脂质体仍然是孤立的，在许多情况下，会平坦地附着在基质上。然而，在突触核蛋白的存在下，大簇迅速形成(第页< 0.0001对CL/PC脂质体的对照）。突触核蛋白对单独含有PC的脂质体没有影响。n个=每组21-22个字段。C类，CL脂质体与80μ米同核蛋白单体，小低聚物(低聚物1)，成熟低聚物(低聚物2)或纤维，并对聚集程度进行量化。只有低聚物1会导致聚集(第页< 0.0001). 每组17–20个字段。
图8。
图8。
重组突触核蛋白驱动人造膜的裂变。 A类，在有或无突触核蛋白（20μ米单体和三聚体），并通过EM进行可视化。比例尺表示100 nm。B类，拍摄分离脂质体的随机场，并量化其面积。累积频率分布表明，突触核蛋白降低了含有CL/PC的细胞的平均面积，但不降低单独含有PC的细胞的平均面积。n个=每组263–1768个脂质体。C类光散射分析表明，共核蛋白（0.3 mg/ml）而非BSA（0.3 mg/ml）导致出现两个脂质体群，一个比原始脂质体群小，另一个较大。图表显示平均值±S.E。，n个=每组11–12口井，来自三个独立实验。
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