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.2011年10月15日；15(8):2185-95.
doi:10.1089/ars.2010.3666。 Epub 2011年6月6日。

高迁移率族框1（HMGB1）激活氧化应激的自噬反应

道林堂 1, 瑞康, 克里斯汀·利弗西, 赫伯特·J·泽三世, 迈克尔·T·洛兹
附属公司

高迁移率族框1（HMGB1）激活氧化应激的自噬反应

道林堂等。 抗氧化剂氧化还原信号. .

摘要

目的：自噬是细胞分解废生化物质和受损成分的过程，在应激后细胞存活中起着重要作用。高迁移率族框1（HMGB1）调节氧化应激反应中的自噬。

结果：外源过氧化氢（H（2）O（2））处理或通过小干扰RNA（siRNA）击倒主要超氧化物清除剂酶超氧化物歧化酶1（SOD1），增加小鼠和人类细胞系的自噬。添加SOD1 siRNA或H（2）O（2）可促进HMGB1在细胞内的表达和细胞外的释放。重要的是，抑制HMGB1的释放或丢失会减少体内和体外氧化应激下的自噬小体数量和自噬通量。

创新：HMGB1的释放可能是氧化应激反应的常见介质。

结论：HMGB1对氧化应激介导的自噬很重要，是治疗应激相关疾病的新靶点。

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数字

图1。
图1。
siRNA敲低SOD1诱导自噬。（A）SOD1下调的时间相关效应。用SOD siRNA或对照siRNA转染MEF。转染指定时间后，用总蛋白提取物进行Western blot分析。肌动蛋白被用作加载控制。所示的免疫印迹是具有类似结果的三个实验的代表。（B、C）LC3的共焦显微分析(绿色)和第62页(红色)在转染SOD1 siRNA后使用特异性抗体，并在MEF中控制siRNA 48小时。图像代表10个随机字段。酒吧=30微米。（要查看彩色插图，请参阅本文的web版本，网址为www.liebertonline.com/ars).
图2。
图2。
抗氧化剂NAC抑制氧化应激诱导的自噬。（A、B）NAC抑制SOD1 siRNA诱导的自噬。用SOD siRNA或对照siRNA转染MEF 48 h，然后用NAC（50 m）处理MEFM（M）)将总蛋白提取物用于Western blot分析。数据代表了三个结果相似的实验（A）.平行地，LC3穿孔形成(绿色)和p62(红色)共聚焦显微镜分析。图像代表10个随机字段。酒吧=30微米（B） ●●●●。（C、D）NAC抑制H2O（运行）2-诱导自噬。MEF用H治疗2O（运行）2（0.05米M（M）)使用或不使用NAC（50 mM（M）)。总蛋白提取物用于Western blot分析。数据是具有类似结果的三个实验的代表（C）.平行地，LC3穿孔形成(绿色)和第62页(红色)共聚焦显微镜分析。图像代表10个随机字段。酒吧=30微米（D）（要查看此彩色插图，请参阅本文的web版本，网址为www.liebertonline.com/ars).
图3。
图3。
SOD1或H的拆卸2O（运行）2增加HMGB1的细胞质转运和释放。（A）HMGB1的共焦显微分析(红色)用SOD1 siRNA转染或控制siRNA 48小时或用h2O（运行）2（0.05米M（M）)使用或不使用NAC 12小时（50米M（M）)在MEF中。酒吧=30微米。10个随机场的核外HMGB1荧光强度的相对定量分析，显示为平均值±SD(*第页<0.05. 单向方差分析，然后是LSD）。AU：任意单位。叠加在差分干涉对比度（DIC）图像上的HMGB1代表性图像如下部面板.（B）含或不含H的线粒体HMGB1水平的Western blot分析2O（运行）2（0.05米M（M）)在MEF中持续12小时。未处理的全细胞裂解液用作非线粒体蛋白的阳性对照（Ctrl）。为了确认这些是合适的组分，对COX IV作为线粒体标记、微管蛋白作为细胞质标记和组蛋白H3作为核标记进行了Western blot检测。（C）条件如所示（A）Western blot分析HMGB1和LDH释放到细胞培养液中的水平。HMGB1谱带密度的相对定量分析，如所示顶部面板（AU：任意单位）。（D）在存在或不存在3-甲基腺嘌呤（“3-MA”，10 m）的情况下，通过ELISA分析HMGB1的释放M（M）)SOD1 siRNA或对照siRNA 48小时后或用h2O（运行）2（0.05米M（M）)同时，使用CCK-8试剂盒分析细胞活力(n个=3, *第页<0.05).（E）Atg5中HMGB1易位的共焦显微镜分析+/+和附件5−/−H治疗后的MEF2O（运行）2（0.05米M（M）)12小时，HMGB1位置的代表性图像(红色)如所示左侧面板。酒吧=30微米。同时，通过ELISA评估HMGB1的释放(n个=3, *第页<0.05).（F）MEF用H治疗2O（运行）2（0.25米M（M）)PARP抑制剂DHIQ（300μM（M）)。治疗后12小时，使用CCK-8试剂盒分析细胞活性(n个＝3*第页<0.05).（G）SOD1 siRNA或对照siRNA处理48小时或用h2O（运行）2（0.05米M（M）)持续12小时(n个=10个随机字段*第页<0.05).（H）RAGE表达缺失增加H2O（运行）2-诱导的氧化细胞毒性。HMGB1标准+/+和HMGB1−/−MEF用H治疗2O（运行）2以指示剂量持续24小时，然后分析细胞活力(n个=3, *第页与HMGB1相比<0.05−/−MEF）。（要查看彩色插图，请参阅本文的web版本，网址为www.liebertonline.com/ars).
图4。
图4。
氧化应激诱导的自噬由HMGB1介导。（A）HMGB1中指示蛋白质水平的Western blot分析+/+和HMGB1−/−转染SOD1 siRNA或对照siRNA 48小时或用h处理后的MEF2O（运行）2（0.05米M（M）)所示的免疫印迹是具有类似结果的三个实验的代表。（B、C）同时，通过共聚焦显微镜分析MEF或HMGB1敲低HCT116和Panc02细胞中LC3突起的形成(*第页<0.05. 单向方差分析，然后是LSD）。KD:HMGB1基因敲除，WT:HMGBI野生型。图像代表10个随机字段。酒吧=30μm（MEF）；酒吧=15μm（HCT116和Panc02）。（D）LC3的协同放大(绿色)/灯2(红色)共聚焦显微镜分析(*第页<0.05. 单向方差分析，随后为LSD），使用（A）。图像代表10个随机字段。Baf A:Bafilomycin A1（100 nM（M）);酒吧=30微米。同时，通过Western blot分析检测LC3的表达(顶部面板).（E）HMGB1标准−/−将野生型或半胱氨酸突变型HMGB1 cDNA转染MEF，然后用H处理2O（运行）2（0.05米M（M）)12小时后，通过共聚焦显微镜分析LC3穿孔的形成(*第页<0.05. 单向方差分析，然后是LSD，n个=10个随机字段）。（要查看彩色插图，请参阅本文的web版本，网址为www.liebertonline.com/ars).
图5：。
图5：。
HMGB1的表达介导化疗耐药体内通过减少细胞凋亡和增强氧化应激期间的自噬流量。（A）HMGB1敲除肿瘤细胞对吉西他滨更敏感体内C57/BLl6小鼠接种106转染对照或HMGB1特异性shRNA后的Panc02肿瘤细胞，并从第10天开始用吉西他滨（GEM，15 mg/kg，两次/周）或PBS治疗。每周测量两次肿瘤，并计算42天的体积(n个=5只小鼠/组，表示为平均值±SD*第页<0.05).（B）第42天，用免疫荧光法检测肿瘤样本中HMGB1的表达、凋亡（TUNEL）、自噬（LC3）和氧化应激（HNE）。（要查看彩色插图，请参阅本文的web版本，网址为www.liebertonline.com/ars).
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