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.2011年2月；3(2):108-24.
doi:10.18632/aging.100285。

microRNA簇miR-106b~25调节成人神经干/祖细胞增殖和神经元分化

杰米·O·布雷特 1, Valérie M雷诺, 维多利亚·A·拉斐尔斯基, 阿什利·韦伯, 安妮·布鲁特
附属公司

microRNA簇miR-106b~25调节成人神经干/祖细胞增殖和神经元分化

杰米·奥布雷特等人。 老龄化（纽约州奥尔巴尼市）. 2011年2月.

摘要

在成年哺乳动物中，神经干细胞（NSC）产生对特定类型的学习和记忆很重要的新神经元。控制成年NSC的数量和功能是维持干细胞库和确保一生中神经发生水平适当的基础。在这里，我们研究了微小RNA基因簇miR-106b~25（miR-106b、miR-93和miR-25）在从成年小鼠分离的神经干/祖细胞（NSPCs）的原代培养中的重要性。我们发现敲低miR-25可以减少NSPC的增殖，而体外表达miR-25则可以促进NSPC的增生。在NSPC中表达整个miR-106b~25簇也能增加其产生新神经元的能力。有趣的是，miR-25有许多潜在的靶mRNA参与胰岛素/胰岛素样生长因子-1（IGF）信号传导，这是一种与衰老有关的途径。此外，miR-106b~25的调节区域受FoxO3的约束，FoxO是FoxO转录因子家族的一员，维持成人干细胞并延长胰岛素/IGF信号下游的寿命。这些结果表明，miR-106b~25调节NSPC功能，是涉及胰岛素/IGF-FoxO通路的网络的一部分，这可能对衰老期间NSC库的稳态具有重要意义。

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利益冲突声明

作者没有利益冲突需要声明。

数字

图1。
图1.miR-106b~25簇在培养的成年NSPC中表达。
(A类)小鼠miR-106b~25簇及其宿主基因Mcm7的基因组位点。(B类)NSPC（12周龄，第2代）在多系分化条件下生长7天（无EGF或bFGF，含1%FBS），然后染色Tuj1（神经元标记物）、GFAP（星形胶质细胞标记物）或O4（少突胶质细胞标记）。比例尺：100μm。(C)通过RT-qPCR检测在自我更新条件（含EGF和bFGF，无FBS）或分化条件（无EGF或bFGF、含1%FBS）下4天的NSPC中miRNA的表达。显示了3种独立NSPC培养物（12周龄，第2代）相对于自我更新条件的基因表达平均值和SEM。单样本双尾t检验，*：p<0.05。
图2。
图2.miR-25是成人NSPC增殖所必需的。
NSPC被转染以敲低miR-106b、miR-93或miR-25，或者被转染一个加扰的对照寡核苷酸。转染两天后，将NSPC与EdU孵育1小时，然后立即固定进行分析。(A类)控制击倒和miR-25击倒的代表性照片。比例尺：100μm。(B类)在5种独立的NSPC培养物上进行实验时，每个条件下EdU+细胞比例的平均值和SEM（年龄8-14周，第3-7代）。配对双尾t检验，**：p<0.01。
图3。
图3 miR-25的表达增强了成人NSPC的增殖。
NSPC感染空对照逆转录病毒（仅表达GFP标记）或表达miR-25的逆转录病毒。感染后约1周，将NSPC培养至完整的神经球，然后分析miRNA的表达和增殖。(A类)用RT-qPCR评估对照组与miR-25过度表达的NSPC中miR-25的表达。显示了2种独立NSPC培养物的平均值和SEM（12周龄，第2-5代）。(B类)每种情况的代表性照片。比例尺：100μm。(C)将对照和miR-25过表达的NSPCs解离并与EdU一起孵育1小时。显示了在4种独立NSPC培养物（12周龄，第3-6代）上进行的实验中，每个条件下EdU+细胞比例的平均值和SEM。配对双尾t检验，*：p<0.05。
图4。
图4.整个miR-106b~25簇的表达也增强了成人NSPC的增殖。
NSPC感染空对照逆转录病毒（仅表达GFP标记）或同时表达miR-106b、miR-93和miR-25（miR-106b~25）的逆转录病毒。感染后约1周，将NSPC培养至完整的神经球，然后分析miRNA的表达和增殖。(A类)miR-106b、miR-93和miR-25的表达通过RT-qPCR在对照组与miR-106b~25过表达的NSPCs中进行评估。显示了4种独立NSPC培养物的平均值和扫描电镜（年龄12-14周，第5-14代）。(B类)每种情况的代表性照片。比例尺：100μm。(C)分离对照组和miR-106b~25过度表达的NSPC，并与EdU或BrdU孵育1小时。显示了在独立NSPC培养物上进行的6个实验（12-14周龄，第3-14代）中，每个条件下EdU+或BrdU+细胞比例的平均值和SEM。配对双尾t检验，*：p<0.05。
图5。
图5..miR-106b~25在培养中促进神经发生。
NSPC感染空对照病毒或病毒以过度表达miR-106b~25.感染后第三天，将NSPC置于分化条件下7天，然后对Tuj1（神经元标记物）进行染色。(A类)每种情况的代表性照片。比例尺：50μm。(B类)显示了在4种独立NSPC培养物（12周龄，第2代）上进行的实验中，为控制感染而归一化的Tuj1+细胞比例的平均值和扫描电镜（SEM）。配对双尾t检验，**：p<0.01。
图6。
图6.miR-25靶向TGFβ和胰岛素/IGF信号传导相关的基因。
(A类)PANTHER基因分类程序用于分析小鼠miR-25的TargetScan靶向保守靶点（总计约600个靶点）。所示为前5种生物途径（按Bonferroni修正的二项式检验p值排序）。(B类)GSEA程序用于分析与（A）中相同的TargetScan靶向列表，使用标准路径和GO基因集类别。显示了前5个类别（按超几何分布生成的p值排序）。(C)DIANA-microT程序用于生成严格的小鼠miR-25靶点列表。所示为KEGG的顶级类别（按皮尔逊的X检验p值排序）。(D类)基于PANTHER通路中TGFβ和胰岛素/IGF-Akt信号通路的通路图，为简单起见进行了修改，并列出了选定的miR-25预测靶点。
图7。
图7.FoxO3与miR-106b~25/Mcm7第一内含子中的一个位点结合。
(A类)FoxO结合位点（FHRE）在miR-106b~25/Mcm7基因第一内含子内的位置，以及用于EMSA、ChIP和荧光素酶实验的序列位置。(B类)EMSA，带有重组FoxO3-GST和与miR-106b~25/Mcm7中FoxO结合位点相对应的放射性标记（热）探针（FHRE WT）。+Ctrl:FoxO3 GST与已知FoxO结合位点的探针一起孵育。通过增加FoxO共识结合序列（FHRE-Mut）突变的未标记（冷）探针或冷探针数量来测试相互作用的特异性。(C)分离野生型和FoxO3-null NSPC，第二天去除生长因子4小时，然后添加LY294002 1小时。针对FoxO3的抗体或对照IgG抗体用于ChIP。qPCR用于评估FHRE和阴性对照位点（-Ctrl）的富集情况。所示为1个实验的相对富集度（12周龄，第10段）。这些结果在ChIP-Seq研究中得到了证实（Webb等人提交）。(D类)HEK 293T细胞与质粒共转染，以表达FoxO3（空白对照，野生型FoxO_3，缺乏DNA结合域的FoxO_2，或组成性核FoxO_4），一个含有FHRE的萤火虫荧光素酶报告子（有或没有FoxO共识序列突变），以及一个Renilla荧光素酶报告子，以使转染效率正常化。作为阳性对照，使用含有已知FoxO3激活位点的荧光素酶报告子（+Ctrl）；作为阴性对照，使用无增强子位点的荧光素酶报告子（-Ctrl）。转染两天后评估荧光素酶活性。显示了4个独立实验（-Ctrl、+Ctrl和FHRE WT）或2个独立实验的平均值和SEM（FHRE Mut）。未配对双尾t检验，**：p<0.01。(E类)分离并培养来自野生型和FoxO3阴性小鼠的NSPC。收集总RNA，通过RT-qPCR评估成熟miR-106b~25成员（相对于5S RNA）和Mcm7 mRNA（相对于β-actin mRNA）的水平。显示了5-6个独立培养物（年龄10-13周，第2-5代）的FoxO3-零/野生型折叠变化的平均值和SEM。单样本双尾t检验，*：p<0.05。
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