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.2011年3月22日；108(12):4846-51.
doi:10.1073/pnas.1102714108。 Epub 2011年3月7日。

胞质分裂期间运输机械所需的内体分选复合体动力学及其在脱落中的作用

娜塔莉·埃利亚 1, 拉希德·苏格拉特, Tighe A马刺, 詹姆斯·赫利, 詹妮弗·利平科特·施瓦茨
附属公司

胞质分裂期间运输机械所需的内体分选复合体动力学及其在脱落中的作用

娜塔莉·埃利亚等。 美国国家科学院程序. .

摘要

胞质分裂的最后阶段是脱落，即切断连接两个子细胞的狭窄膜桥。胞质分裂需要运输（ESCRT）机械所需的内体分选复合体，ESCRT-III在体外具有膜断裂活性，但ESCRT在脱落中的作用尚未明确。在这里，我们使用结构照明显微镜和延时成像来解剖ESCRT在脱落过程中的行为。我们的数据显示，ESCRT-I亚单位肿瘤易感基因101（TSG101）和ESCRT-III亚单位荷电多泡体蛋白4b（CHMP4B）依次被招募到细胞间桥的中心，形成一系列皮质环。然而，在胞质分裂后期，CHMP4B被急性补充到发生脱落的狭窄收缩部位。ESCRT分解因子空泡蛋白分选4（VPS4）跟随CHMP4B到达该位点，细胞立即分离。ESCRT-III和VPS4的到来在空间和时间上与脱落事件相关，这表明这些蛋白在细胞因子膜脱落中起着直接作用。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
胞质分裂期间细胞间桥的解剖学特征。(一个)胞质分裂早期到晚期（从左到右）MDCK细胞细胞间桥的EM切片显示，中体暗区（直径1μm，宽度0.6μm）由收缩区（箭头）分隔，收缩区相隔2μm，直径0.1–0.5μm。（比例尺：1μm）(B类)胞质分裂中MDCK细胞细胞间桥的AFM研究。图中显示了不同比例的同一中身的偏转通道和放大图像的高度通道。沿着细胞间桥的高度剖面图显示出两个收缩区，相隔2μm，位于中体最高点下方150–200 nm处。（比例尺：左侧，5微米；赖特.2μm）(C类)在胞质分裂期间表达α-微管蛋白–GFP的活MDCK细胞。根据荧光强度分布图测量的中体残余物长度（参见bar）为2.18±0.35μm(n个=17）（比例尺：2μm）。(D类)在胞质分裂期间，微管直径在箭头所示位置随时间的相对变化。微管直径标准化为每个细胞测得的最大直径。脱落时间（时间0）定义为微管桥首次断裂的时间。n个=17。(电子) (左侧)表达AuroraB-GFP的MDCK细胞细胞间桥的SIM图像。(赖特)胞质分裂期间表达AuroraB-GFP（绿色）和α-微管蛋白–mCherry（红色）的细胞的活细胞成像。n个= 4. （比例尺：2μm）
图2。
图2。
由SIM确定的中体ESCRT复合体的空间组织。表达CEP55-GFP的MDCK细胞(一个)，TSG101-GFP(B类)，或CHMP4B mCherry(C类和D类)同步、固定，用抗α-微管蛋白抗体染色，并通过SIM成像。(一个–D类)每个面板显示（从左到右）一个切片、一个3D渲染、一个旋转90°的3D渲染和一个结构的放大图像。微管呈白色，CEP55-GFP呈绿色，TSG101-GFP呈橙色，CHMP4B-樱桃呈红色(一个)CEP55形成扩散填充结构，直径为1.4±0.15μm，宽度为0.75±0.07μm。n个= 10. MKLP1也观察到类似的结构(图S3一个). （比例尺：2μm）(B类)TSG101在中体暗区中心的微管周围形成紧密堆积的双环结构（宽度=0.82±0.03μm）。环的外径为1.7±0.07μm，间距为0.23±0.02μm。(插入)旋转图像显示存在两个单独的环(n个= 5). (C类和D类)CHMP4B集中在两个间隔0.43±0.08μm的断裂环中。每个断裂环的直径为1.25±0.18μm。在一些细胞中，CHMP4B还显示了一个额外的池，该池位于距离暗区中心1.2μm的不对称位置（如箭头所示D类)并与微管收缩部位完美共定位。(插图)仅CHMP4B信号(n个= 14). 所有测量中微管的平均直径（不包括D类)为0.98±0.12μm。定位于暗区的蛋白质测得的较大直径与使用膜标记物（1.6μm；图S3). 暗区（无微管染色区）宽度为0.7±0.1μm。(电子)MDCK细胞分裂的细胞间桥上内源性CHMP4A（红色）和微管蛋白（白色）抗体染色的共焦三维重建图像。图像与SIM描述的CHMP4B-mCherry定位一致(D类). (F类)整合上述SIM测量值的中体ESCRT组织模型。
图3。
图3。
接受胞质分裂的MDCK细胞的活细胞成像揭示了ESCRT成分向中体隆起的顺序募集。表达低水平CEP55-GFP的细胞(一个)，TSG101-GFP(B类)和CHMP4B-樱桃(C类)与α-微管蛋白-樱桃(一个和B类)或α-微管蛋白–GFP(C类)用旋转圆盘共焦显微镜每隔7分钟成像一次。每个面板显示了胞质分裂不同阶段微管（红色）和特定蛋白质（绿色）的最大强度投影合并图像。仅感兴趣的蛋白质的最大强度投影如下所示。根据每个时间点的总强度投影测量背景以上的强度，并绘制在每个面板的右侧。背景强度或更低设置为0。时间0被确定为第一次微管破裂的时间。箭头在C类表示CHMP4B信号急性增加的部位。所分析细胞的平均胞质分裂时间为CEP55，89±9 min(一个); TSG101105±12分钟(B类); 和CHMP4B，102±16分钟(C类). 这些值在MDCK细胞胞质分裂的正常范围内，即110±30分钟内脱落（在50个稳定表达α-微管蛋白–GFP的MDCK电池中测量）。SIM观察到的TSG101的双环结构在这里无法解析，因为它低于该系统的光学分辨率。n个= 8. （比例尺：2μm）
图4。
图4。
收缩部位CHMP4B和VPS4B水平的急性升高与微管桥的急性收缩时间密切相关。表达CHMP4B-樱桃（绿色）和α-微管蛋白-GFP（红色）的MDCK细胞(一个)或VPS4B-GFP（绿色）和α-tubulin–mCherry（红色）(B类)在胞质分裂期间拍摄。显示的图像是最后一个分离步骤的连续帧。(一个和B上部)上面的行显示CHMP4B的覆盖(一个)或VPS4B(B类)微管信号；下一行仅显示微管蛋白信号。(一个和B下部)CHMP4B微管直径和荧光强度变化图(一个)或VPS4B(B类)在收缩区（见图表右侧的图表）。（比例尺：2μm）(C类)绘制了收缩带中CHMP4B和VPS4B相对于脱落事件的平均峰值时间（时间0）。n个= 5.
图5。
图5。
ESCRT介导的脱落的建议模型。(一个)在晚期胞质分裂期间每隔3分钟对表达CHMP4B-樱桃（绿色）和α-微管蛋白-GFP（红色）的MDCK细胞进行成像。(上部)显示的图像是合并图像（上排）和CHMP4B通道（下排）的连续帧。（比例尺：2μm）(左下方)该图显示了即将断裂的一侧CHMP4B强度的变化。(右下角)该图显示了最高强度CHMP4B像素和最低强度CHMP3B像素（位于两个初始环之间）之间的距离，该距离是从沿着断裂侧的中桥绘制的线强度剖面测量的。该测量值用于指示第二个CHMP4B池相对于中体中心的位置。时间0被确定为CHMP4B强度达到最大值的时间。n个= 5. (B类)细胞因子脱落过程中ESCRT介导的收缩和分裂的建议模型。CEP55（绿色）、TSG101（黄色）和CHMP4B（红色）在中体中心的组装形成了开始脱落的平台。在离体更近的时候，ESCRTIII水平在中段增加，然后重新定位到收缩区，可能是通过聚合形成螺旋。这种再定位引起收缩，随后细胞间桥断裂，导致两个子细胞完全分离。
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