Toll-like receptor 3 is required for development of retinopathy caused by impaired all-trans-retinal clearance in mice

doi:10.1074/jbc.M111.228551

.2011年4月29日；286(17):15543-55.

doi:10.1074/jbc。M111.228551。 Epub 2011年3月7日。

Toll样受体3是小鼠全经视网膜清除受损引起的视网膜病变发展所必需的

Satomi Shiose公司¹, 于晨, 冈野纪一郎, 萨尼塔·罗伊, Hideo Kohno先生, 曾冠豪, 埃里克·皮尔曼, 前田忠道, 克日什托夫·帕尔琴夫斯基, 前田昭子

附属公司

PMID： 21383019
预防性维修识别码：项目经理3083179
内政部： 10.1074/jbc。M111.228551号

Toll样受体3是小鼠全经视网膜清除受损引起的视网膜病变发展所必需的

Satomi Shiose公司等。生物化学杂志. 2011.

.2011年4月29日；286(17):15543-55.

doi:10.1074/jbc。M111.228551。 Epub 2011年3月7日。

作者

Satomi Shiose公司¹, 于晨, 冈野纪一郎, 萨尼塔·罗伊, Hideo Kohno先生, 曾冠豪, 埃里克·皮尔曼, 前田忠道, 克日什托夫·帕尔琴夫斯基, 前田昭子

附属

¹美国俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学药理学系，邮编44106。

PMID： 21383019
预防性维修识别码：项目经理3083179
内政部： 10.1074/jbc。M111.228551号

摘要

慢性炎症是许多与年龄相关的神经退行性疾病（包括黄斑变性）的重要组成部分。在这里，我们报道了toll-like receptor 3（TLR3）在缺乏ATP-binding caste transporter 4（ABCA4）和视黄醇脱氢酶8（RDH8）的小鼠的锥体营养不良（CORD）中的作用，这些蛋白对视网膜的全跨视网膜清除至关重要。通过RNA表达分析，在Rdh8（-/-）Abca4（-/--）眼中观察到toll样受体信号元件的表达增加和炎症变化。与3个月大的Rdh8（-/-）Abca4（-/-）小鼠发生CORD不同，6个月大的Tlr3（-/-）Rdh8（-/-）Abca4（-/-）小鼠没有表现出异常的视网膜表型。Tlr3（-/-）Rdh8（-/--）Abca4（-/---）小鼠的光诱导视网膜变性比Rdh8。TLR3配体Poly（I-C）导致caspase-8非依赖性细胞凋亡。在体内和体外，poly（I-C）在Rdh8（-/-）Abca4（-/-]）和WT小鼠中诱导视网膜细胞死亡，而在缺乏Tlr3的小鼠中未发现这种情况。与3个月龄和6个月龄的Rdh8（-/-）Abca4（-/--）小鼠相比，Tlr3（-/-Rdh8）Abca4[-/-]小鼠的视网膜下间隙中侵袭性巨噬细胞/小胶质细胞更少，Muller胶质细胞的激活较弱，表明Tlr3的缺失抑制了视网膜的局部炎症。来自死亡/死亡视网膜细胞的聚（I-C）和内源性产物均诱导NF-κB和IRF3活化。这些发现表明，视网膜退化产生的内源性产物刺激TLR3，从而导致细胞凋亡和视网膜炎症，TLR3的缺失可保护小鼠免受CORD的影响。

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数字

**图1。**
**删除*第三阶段*防止视网膜退化*第8路*^−/−*阿布卡4*^−/−老鼠。** A类，在*第三阶段*^−/− *第8路*^−/−*阿布卡4*^−/−,*第8路*^−/−*阿布卡4*^−/−,*第三阶段*^−/−和3个月龄和6个月龄的WT小鼠(米). 用抗视紫红质抗体对3月龄小鼠的冷冻切片进行染色(红色)、花生凝集素凝集素(绿色)，和4′-6-二氨基-2-苯基吲哚(蓝色) (*顶部面板*). 还显示了3个月和6个月大小鼠的Epon-prepared视网膜(*中间的*和*下部面板*). 视网膜明显变性，视紫红质定位错误*第8路*^−/−*阿布卡4*^−/−小鼠，而其他小鼠没有表现出明显的视网膜损伤。酒吧指示10μm。*操作系统*，外段；是，内段；*ONL公司*，外核层；*印度卢比*，内核层；*零售物价指数*，视网膜色素上皮；*OPL公司*外丛状层；*IPL公司*，内丛状层。B类，WT的全场ERG响应，*第三阶段*^−/−*第8路*^−/−*阿布卡4*^−/−、和*第8路*^−/−*阿布卡4*^−/−6个月大的小鼠。在暗视条件下记录ERG反应。两者a-(左边)和b-(*正确的*)作为光强函数绘制的波幅在6个月大的婴儿中显著减弱*第8路*^−/−*阿布卡4*^−/−小鼠与*第三阶段*^−/−*第8路*^−/−*阿布卡4*^−/−和野生动物。酒吧注明平均值的S.E(n个> 6; *,第页< 0.01),*第8路*^−/−*阿布卡4*^−/−老鼠*与Tlr3相比*^−/−*第8路*^−/−*阿布卡4*^−/−动物。光盘坎德拉。

**图2。**
**Tlr3缺失可保护视网膜免受光诱导的急性退化。** *第三阶段*^−/−*第8路*^−/−*阿布卡4*^−/−,*第8路*^−/−*阿布卡4*^−/−和4周龄的WT小鼠分别暴露于10000 lux光照下30和60分钟，然后在进行SLO和组织学检查时在黑暗中放置7天。A类，外核层厚度(*ONL公司*)如图所示。*ONH公司*，视神经头。*误差线*注明平均值的S.D(n个> 3). 年观察到严重的视网膜变性*第8路*^−/−*阿布卡4*^−/−小鼠在强光照射30分钟后，但在*第三阶段*^−/−*第8路*^−/−*阿布卡4*^−/−和WT视网膜。然而，两组患者都出现了严重的光诱导视网膜变性*第三阶段*^−/−*第8路*^−/−*阿布卡4*^−/−小鼠和*第8路*^−/−*阿布卡4*^−/−小鼠暴露在强光下60分钟后。*B、上部面板*，显示了30分钟光照小鼠的视网膜组织学。*零售物价指数*，视网膜色素上皮；*操作系统*，外段；是，内段；*ONL公司*，外核层；*OPL公司*外丛状层；*印度卢比*，内核层。酒吧表示20μm。*下部面板*，给出了4周龄小鼠在10000勒克斯光照射30分钟后7天通过SLO获得的具有代表性的视网膜外侧图像。照明中可见大量自荧光沉积物*第8路*^−/−*阿布卡4*^−/−小鼠缺席*第三阶段*^−/−*第8路*^−/−*阿布卡4*^−/−和WT小鼠。C类，RT-PCR用于*第三阶段*和aGapdh公司照明与非照明视网膜的内部控制*第8路*^−/−*阿布卡4*^−/−展示的是老鼠。的表达式*第三阶段*强光照射后增加。

**图3。**
聚（I-C）诱导ARPE19细胞和原代培养RPE细胞死亡*第8路*^−/−*阿布卡4*^−/−和WT小鼠，但不是来自*第三阶段*^−/−*第8路*^−/−*阿布卡4*^−/−,*第三阶段*^−/−，或*特里夫*^−/−老鼠。 A类将ARPE19细胞（人RPE）与TLR3配体poly（I-C）在0、50、100和200μg/ml的浓度下孵育24 h，然后用Hoechst 33342对细胞进行染色。显示了代表性的ARPE19细胞图像。凋亡细胞显示染色质凝集。B类，染色质浓缩细胞数/mm²被计算在内。Poly（I-C）以剂量依赖性方式导致ARPE19细胞死亡。*误差线*注明平均值的S.D(n个> 3).C类，从6周龄婴儿中分离出原代RPE细胞*第三阶段*^−/−*第8路*^−/−*阿布卡4*^−/−,*第8路*^−/−*阿布卡4*^−/−,*第三阶段*^−/−,*特里夫*^−/−和WT小鼠，如“实验程序”所述。RPE细胞在培养8天后的典型图像如*插图。数字*用Hoechst 33342/mm染色的染色质浓缩细胞²被计算在内。在RPE细胞中观察到聚（I-C）诱导的细胞死亡*第8路*^−/−*阿布卡4*^−/−和WT小鼠在37°C共同孵育24小时后，而在来自*第三阶段*^−/−*第8路*^−/−*阿布卡4*^−/−和*第三阶段*^−/−小鼠(第页<0.001，聚（I-C）为100μg/ml）。RPE来自*特里夫*^−/−小鼠表现出一些聚（I-C）诱导的细胞死亡，但其数量远低于WT小鼠(第页在100μg/ml时<0.001）。*误差线*注明平均值的S.D(n个> 3).

**图4。**
**聚（I-C）诱导WT视网膜变性。**将聚（I-C）（1μl，PBS中1μg/μl）注入8周龄WT的视网膜下间隙，*第三阶段*^−/−、和*特里夫*^−/−老鼠。注射后第0-3天，对注射了聚（I-C）或PBS的眼睛使用不含抗炎药的抗生素滴眼液。A类视网膜广泛受损，外核丢失(*ONL公司*)SD-OCT显示WT小鼠的光感受器层，而在*第三阶段*^−/−或*特里夫*^−/−小鼠注射后4周。B类术后4周，用连接CCD相机的手术显微镜（徕卡M651 MSD）采集眼底图像。用HOYA HHV Dispo型6d透镜去除角膜的异常反射。聚乙烯（I-C）注射WT眼出现萎缩性改变*粉红色*与PBS注射WT视网膜相比，着色。萎缩变化的区域由*黄色箭头*.

**图5。**
*第三阶段*^−/−*第8路*^−/−*阿布卡4*^−/−小鼠自身荧光视网膜下巨噬细胞/小胶质细胞数量减少，Muller胶质细胞激活较弱。SLO视网膜图像取自3个月和6个月大的婴儿*第三阶段*^−/−*第8路*^−/−*阿布卡4*^−/−,*第8路*^−/−*阿布卡4*^−/−,*第三阶段*^−/−、和WT小鼠(A类)，并显示已识别荧光点的数量(B类). 3个月大时出现自体荧光斑点*第8路*^−/−*阿布卡4*^−/−小鼠，在6个月大的时候发现数量要多得多*第8路*^−/−*阿布卡4*^−/−动物。然而，*第三阶段*^−/−*第8路*^−/−*阿布卡4*^−/−老鼠显示的这些斑点远远少于*第8路*^−/−*阿布卡4*^−/−老鼠。6个月大的Epon-prepared组织切片*第8路*^−/−*阿布卡4*^−/−小鼠表现出迁移的巨噬细胞/小胶质细胞(*黄色箭头*)在视网膜下部光感受器和视网膜色素上皮之间(*B、插入*).操作系统，外段；是，内段；在线，外核层。酒吧表示10μm。C类，检测GFAP的表达*第8路*^−/−*阿布卡4*^−/−和*第三阶段*^−/−*第8路*^−/−*阿布卡4*^−/−视网膜。用抗GFAP抗体对3个月龄小鼠的下视网膜冷冻切片进行染色(红色)和DAPI(蓝色). 3个月大的Muller细胞*第8路*^−/−*阿布卡4*^−/−小鼠全身显示GFAP免疫反应，而在*第三阶段*^−/−*第8路*^−/−*阿布卡4*^−/−老鼠。*公共关系*光感受器；*ONL公司*，外核层；*OPL公司*外丛状层；*印度卢比*，内核层；*IPL公司*内丛状层；*GCL公司*神经节细胞层。酒吧表示10μm。

**图6。**
**与所有细胞共同培养的感光细胞产生的内源性产物-反式-视网膜激活TLR3。** A类将含有过度表达hTLR3（hTLR3-ARPE19细胞）的ARPE19和ARPE19电池与含有降解Y79细胞产物的上清液（40μl HEK-Blue检测介质中的20μl上清液）或聚（I-C）（50μg/ml）在96个平板中共同培养，在37°C下共同培养6小时后，通过监测620 nm处检测介质的吸光度来评估NF-κB的报告活性。*误差线*注明平均值的S.D(n个> 3).B类此外，还对HEK293细胞的NF-κB报告活性进行了测量，该细胞具有或不具有过度表达的hTLR3（hTLR3-HEK292），与含有降解Y79细胞产物的上清液（40μl HEK-Blue检测介质中的20μl上清液）或聚（I-C）（50μg/ml）在96 well平板中共同培养。在37°C下共同培养16小时后，在620 nm处监测吸光度。*误差线*注明平均值的S.D(n个> 3).C类，IFR3的报告活性是通过hTLR3-HEK293的荧光素酶测定来测定的，hTLR3与含有降解Y79细胞产物的上清液（200μl）共同培养(*H（H）*)或40微升(*L（左）*)300或460μl培养基中的上清）、含有降解Y79细胞产物的上清（300μl培养液中的上清液为200μl），用苯甲酸酶®（20单位/ml）预处理1 h，并在70°C下加热5 min以使酶poly（I-C）（50μg/ml(*H（H）*)或10μg/ml(*L（左）*))、脂多糖(*液化石油气*10μg/ml），或全部-反式-视网膜（3μ米)在24孔板中。在37°C共孵育6小时后测量萤光素酶活性，并计算PBS处理的细胞的倍数变化。*误差线*注明平均值的S.D(n个> 3).D类，NF-κB p65亚单位核转位用来自*第三阶段*^−/−*，特里夫*^−/−和WT小鼠与含有降解Y79细胞产物的上清液（未经任何稀释的上清）孵育后，上清液含有用苯甲酸酶®（20单位/ml）预处理1小时并在70°C下加热5分钟以使酶或聚（I-C）（10μg/ml）失活2小时的降解Y79电池产物。含有降解Y79细胞和poly（I-C）产物的上清液可诱导p65核移位，但Bensonase®治疗可阻止WT巨噬细胞的这种移位。骨髓来源的巨噬细胞*第三阶段*^−/−和*特里夫*^−/−小鼠未能转移p65亚单位。

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