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.2011年3月15日；108(11):4340-5.
doi:10.1073/pnas.1011115108。 Epub 2011年2月23日。

维生素A和视黄醇结合蛋白的信号调节基因表达以抑制胰岛素反应

丹尼尔·贝里 1, Hui Jin公司, 阿维吉特·马朱姆达尔, 诺亚·诺伊
附属公司

维生素A和视黄醇结合蛋白的信号调节基因表达以抑制胰岛素反应

丹尼尔·贝里等。 美国国家科学院程序. .

摘要

目前，人们认为维生素A、视黄醇通过活性代谢物发挥作用：视觉发色团11-顺-视黄醇和视黄醇酸，它们调节基因转录。视黄醇在血液中循环，与视黄醇结合蛋白（RBP）结合，并通过一种称为“维甲酸6刺激”（STRA6）的膜蛋白转运到细胞中。我们在这里表明，STRA6不仅是一种维生素a转运蛋白，而且是一种被RBP视黄醇复合物激活的细胞表面信号受体。RBP-视黄醇与STRA6的结合触发酪氨酸磷酸化，导致JAK2和转录因子STAT5的招募和激活。RBP-视黄醇/STRA6/JAK2/STAT5信号级联诱导STAT靶基因的表达，包括抑制胰岛素信号传导的细胞因子信号抑制因子3（SOCS3）和增强脂质积聚的过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）。这些观察结果确立了亲代维生素A分子本身是一种转录调节因子，揭示了维生素的生物功能范围比先前怀疑的更广，并为理解RBP和视黄醇如何调节能量稳态和胰岛素反应提供了理论依据。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
RBP-ROH诱导STRA6磷酸化，触发JAK2和STAT5的募集和激活。(A类)用携带STRA6的载体转染HepG2细胞。转染24 h后用RBP-ROH（1μM）处理细胞，并在指定时间进行裂解。对STRA6进行免疫沉淀，并对沉淀进行磷酸酪氨酸印迹。(B)如图所示转染HepG2细胞。蛋白质的类似过度表达在(图S2A类). 用RBP-ROH（1μM；15分钟）处理细胞，STRA6-免疫沉淀，并进行磷酸酪氨酸印迹。(C类)如图所示转染HepG2细胞。如图所示，STRA6沉淀，沉淀被吸干。(D类)中条带的量化B和C类在三个独立的实验中。(*P（P）=0.05 vs.STRA6转染的非处理细胞。）(E类) (上部)HepG2细胞按指示处理，STAT5免疫沉淀，沉淀印迹STRA6和总STAT5。(下部)在三个独立实验中对谱带进行量化。(**P（P）= 0.01.) (F类)用胰岛素（15分钟，25 nM）、生长激素（GH，500 ng）或RBP-ROH处理HepG2细胞。对裂解液进行磷酸化STAT5（pSTAT5，Y694）和总STAT5的免疫印迹。(G公司)用标记的配体（1μM；15分钟）处理HepG2细胞，并对标记蛋白的裂解产物进行印迹。(H（H）)用RBP-ROH处理细胞，并对裂解产物进行pSTAT5（pY694）和总STAT5的印迹。(我)如图所示转染细胞，并用RBP-ROH（1μM；15分钟）处理细胞，并按图所示对裂解产物进行免疫印迹。(J型)用STRA6编码载体转染HepG2细胞，用RBP-ROH处理（1μM；15分钟），裂解，免疫沉淀STRA6。对沉淀进行JAK2免疫印迹。(K（K）)如图所示转染HepG2细胞，用RBP-ROH处理（1μM；15分钟），裂解，并对pJAK2（Y1007/1008）和总JAK2进行免疫印迹。(L（左）和M（M）)用STAT反应元件驱动的荧光素酶报告子和β-半乳糖苷酶表达载体共同转染HepG2细胞。(L（左）)用指定的配体（1μM）或胰岛素（5 nM）处理细胞。25小时后裂解细胞，测量荧光素酶活性并将其归一化为β-半乳糖苷酶。（平均值±SEM*P（P）<0.02与未经处理的对照；n个= 3.) (M（M）)使用转染有指定载体的细胞进行反激活分析。用RBP-ROH处理细胞24小时，荧光素酶活性归一化为β-半乳糖苷酶。（平均值±扫描电镜*P（P）<0.02与未经处理的对照；#P（P）与转染空载体的RBP-ROH处理细胞相比，<0.05；n个= 3.)
图2。
图2。
RBP-ROH以STRA6和JAK2介导的方式激活STAT。(A类)用指定的配体处理HepG2细胞（1μM；4 h）。用qPCR方法检测SOCS3和PPARγ。（平均值±SEM*P（P）与未处理对照组相比，<0.01；n个= 3.) (B)用RBP-ROH或RA处理HepG2细胞（1μM；4 h）。用qPCR检测SOCS3、PPARγ和CYP26a的mRNA。（平均值±扫描电镜*P（P）<0.02与未经处理的对照；n个= 3.) (C类)用指定的配体处理细胞（1μM；4 h）。qPCR检测SOCS3和PPARγmRNA。（平均值±SEM*P（P）与未处理对照组相比，<0.01；n个= 3.) (D类)用RBP或组氨酸标记的缺乏分泌信号的RBP表达载体转染细胞（his-RBPΔN）。用载体或ROH处理细胞（1μM；4 h），用qPCR检测SOCS3 mRNA。（平均值±SEM*P（P）与相应的未处理对照组相比，<0.01；n个= 3.) (插入)免疫印迹显示标记蛋白过度表达。(E类)如图所示转导细胞。通过qPCR验证了STRA6的下调(图S1G公司). 48小时后，用ROH、RBP、RBP-ROH（1μM）或IL-6（5 ng）处理细胞4小时。用qPCR检测SOCS3 mRNA。（平均值±SEM*P（P）与未处理对照组相比，<0.01**P（P）<0.02 vs.转染空载体的RBP-ROH处理细胞；n个= 3.) (F类)如图所示转染HepG2细胞。免疫印迹证实了类似的蛋白质过度表达(图S2A类). 用RBP-ROH（1μM；4小时）处理细胞。（平均值±SEM*P（P）与未处理对照组相比，<0.01**P（P）与转染空载体的未处理细胞相比，<0.05；#P（P）与转染空载体的RBP-ROH处理细胞相比，<0.05；n个= 3.) (G公司)如图所示转染细胞。qPCR验证过表达(图S1F类). 转染48 h后，用指定的配体（1μM；4 h）处理细胞。测量SOCS3 mRNA。（平均值±SEM*P（P）与转染空载体的未处理细胞相比，<0.05**P（P）与转染空载体的RBP-ROH处理细胞相比，<0.05；n个= 3.) (H（H）)用JAK抑制剂AG490或ZM449829（50μM）预处理细胞24 h，然后用RBP-ROH（1μM；4 h）处理细胞。测量SOCS3 mRNA。（平均值±SEM*P（P）与未处理细胞相比，<0.01；n个= 3.) (我)用空慢病毒载体或携带shRNAs的慢病毒载体转染细胞。48 h后用RBP-ROH（1μM；4 h）处理细胞。测量SOCS3 mRNA（平均值±SEM*P（P）与转染空载体的RBP-ROH处理细胞相比，<0.01；n个= 3.) (插图)免疫印迹显示JAK下调。
图3。
图3。
RBP-ROH/STRA6/STAT5通路损害胰岛素反应。(A类和B)用胰岛素（20 nM；25 min）或RBP-ROH（1μM；8 h）处理分化的脂肪细胞，或在用胰岛素处理前用RBP-ROH预处理8 h。(上部)对裂解液进行磷酸化胰岛素受体（pIR-Y1146）和总胰岛素受体（IR）的免疫印迹(A类)或磷酸化Akt（pAkt1-S473）和总Akt1(B). (下部)磷酸化/总蛋白的定量。（所示数据为平均值±SEM；#P（P）<0.02与未经RBP-ROH预处理的对照组相比；n个= 3. (C类)用ROH或RBP处理分化的脂肪细胞（1μM；8 h），然后用胰岛素处理（20 nM；25 min）。(上部)如图所示，对裂解液进行免疫印迹。(下部)免疫印迹的定量。（所示数据为平均值±SEM；n个= 3.) (D类和E类)分化脂肪细胞(D类)或HepG2细胞(E类)用携带指示shRNAs的慢病毒转导5天。qPCR和/或免疫印迹证实靶蛋白表达降低(图S3E类,S4系列B、和第5章C类和D类). 用胰岛素（20 nM；25 min）或RBP-ROH（1μM；8 h）处理细胞，或在用胰岛素处理之前用RBP-ROH预处理8 h。如左图所示，对裂解物进行免疫印迹D类和上部面板E类。实验进行了两次，结果相似。右面板中D类和下部面板E类显示数据的量化，两个独立实验的平均值。(F类)分化的脂肪细胞用载体或胰岛素（20 nM；25分钟）处理，或在用胰岛素处理之前用RBP-ROH（1μM；8小时）预处理。获得了粗质膜组分（cpm）（27）。(左侧)免疫印迹显示cpm中Na-K ATP酶富集。(赖特)cpm中GluT4的免疫印迹。质膜标记物Na-K ATP酶作为负荷控制。
图4。
图4。
RBP触发STRA6、STAT5和JAK2的磷酸化，上调STAT靶基因的表达，并抑制体内胰岛素信号传导。(A类)用qPCR测定白色脂肪组织（WAT）、骨骼肌（SM）和肝脏中的STRA6 mRNA。（所示数据为三只小鼠的平均值±SEM。）(插入)两只小鼠白色脂肪组织、骨骼肌和肝脏中STRA6的免疫印迹。(B) (上部)瘦鼠、肥胖鼠和注射RBP的瘦鼠血清RBP的免疫印迹。显示了每组两只动物的结果。(下部)血浆RBP的定量。（所示数据为平均值±SEM*P（P）<0.03 vs.瘦小鼠；n个=每组3只小鼠。）(C类)STRA6从三只对照（缓冲液）和三只注射RBP的小鼠的白色脂肪组织中进行免疫沉淀（IP），并对磷酸酪氨酸进行免疫印迹。(D类)四只对照（缓冲液）和四只RBP注射小鼠白色脂肪组织中pSTAT5和总STAT5的免疫印迹。(E类) (左侧)三只对照（缓冲液）和三只RBP注射小鼠WAT中pJAK2、PPARγ和SOCS3的免疫印迹。(赖特)量化归一化为β-肌动蛋白的指示蛋白质。(*P（P）<0.05，与缓冲注射控制相比。）(F类)对照组（缓冲组）和RBP注射小鼠白色脂肪组织和骨骼肌中SOCS3 mRNA的表达。（显示的数据为平均值±SEM*P（P）与缓冲注射小鼠相比，<0.05；n个=每组3人。）(G公司)注射缓冲液或RBP的小鼠白色脂肪组织中PPARγmRNA。（所示数据为平均值±SEM*P（P）与缓冲注射小鼠相比，<0.05；n个=每组4个。）(H（H）–J型) (上部)白色脂肪组织中胰岛素受体和Akt1的磷酸化水平(H（H）)、骨骼肌(我)，和肝脏(J型)注射缓冲液或RBP的小鼠。(下部)量化归一化为总Akt1的带强度。（所示数据为平均值±SEM*P（P）< 0.05;n个=每组3人。）
图5。
图5。
RBP-ROH/STRA6/JAK/STAT通路模型。RBP-ROH与STRA6细胞外部分的结合触发受体胞质域中SH2结构域结合基序内的酪氨酸磷酸化。磷酸化的STRA6招募并激活JAK2，JAK2反过来磷酸化STAT5。活化的STAT5转位到细胞核以调节靶基因的表达，包括抑制胰岛素信号传导的SOCS3和增强脂质积累的PPARγ。STRA6模型（GeneID 64220RBP）是使用软件生成的http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/susi如参考文献所述，解决了holo-RBP（GenBank登录号DAA14765.1）的3D结构。
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