Caloric restriction and resveratrol promote longevity through the Sirtuin-1-dependent induction of autophagy

doi:10.1038/cddis.2009.8

.2010;1（1）：e10。

doi:10.1038/cddis.2009.8。

热量限制和白藜芦醇通过Sirtuin-1依赖性诱导自噬促进长寿

E莫塞利¹, M C迈乌里, M马卡基, E Megalou公司, 帕斯帕拉基人, K巴利卡拉斯, 克里奥罗, 加卢齐, 萨马利克, I Vitale公司, M米肖, F马迪奥, N塔维纳拉基斯, G克罗默

附属公司

PMID： 21364612
预防性维修识别码：项目经理3032517
内政部： 10.1038/cddis.2009.8

热量限制和白藜芦醇通过依赖Sirtuin-1的自噬诱导延长寿命

E莫塞利等。细胞死亡疾病. 2010.

.2010;1（1）：e10。

doi:10.1038/cddis.2009.8。

作者

E莫塞利¹, M C迈乌里, M马卡基, E Megalou公司, 帕斯帕拉基人, K巴利卡拉斯, 克里奥洛, 加卢齐, 萨马利克, I Vitale公司, M米肖, F马迪奥, N塔维纳拉基斯, G克罗默

附属

¹INSERM，U848，Villejuif F-94805，法国。

PMID： 21364612
预防性维修识别码：项目经理3032517
内政部： 10.1038/cddis.2009.8

摘要

限制热量摄入和诱导自噬的药物可以延长模型生物的寿命，包括小鼠、苍蝇和线虫。在本研究中，我们表明Sirtuin-1转基因表达在体外的人类细胞和体内秀丽隐杆线虫中诱导自噬。Sirtuin-1的敲除或敲除阻止了白藜芦醇、人类细胞中的营养剥夺以及秀丽隐杆线虫的饮食限制对自噬的诱导。相反，无论是在人类细胞中还是在秀丽隐杆线虫中，通过雷帕霉素或p53抑制诱导自噬都不需要Sirtuin-1。Sirtuin-1的敲除或药物抑制增强了人类细胞对代谢应激的易感性，除非通过雷帕霉素或p53抑制治疗刺激细胞进行自噬。同样，白藜芦醇和饮食限制只会延长自噬线虫的寿命，而这些对寿命的有益影响因必需的自噬调节剂Beclin-1的敲除而消失。我们的结论是，限制热量摄入和药理性Sirtuin-1激活剂的寿命延长作用普遍需要自噬。

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数字

图1
Sirtuin-1（Sirt-1）诱导自噬空泡化，对自噬体-溶酶体融合无影响。(一–**c（c）**)检测野生型（WT）HCT 116中Sirt-1过度表达诱导的自噬空泡和EX527的调节。将表达GFP-LC3的质粒与空白对照载体（pcDNA3）或Sirt-1编码质粒共同转染细胞24小时，然后在没有或存在100个质粒的情况下培养6小时μM EX527。面板中报告了代表性的显微照片一以及在点状细胞（GFP-LC3^真空)在面板中报告b条（平均值±标准误差。，n个=3,^**P（P）*<0.05). 免疫印迹法测定赖氨酸382乙酰化的Sirt-1、p53（p53 Ac Lys382）、总p53以及LC3成熟度的丰度。对甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）水平进行评估，以确保车道负载相等。(**c（c）**)三个独立实验的代表。波段旁边的数字表示MW（kDa）。(d日–**（f）**)巴非霉素A1（BafA1）对Sirt-1诱导的自噬空泡化的影响。用pcDNA3控制载体或Sirt-1编码质粒转染表达GFP-LC3的HeLa细胞24小时，再用1 nM BafA1处理6小时，最后处理以评估GFP-LC3-和LAMP-2之间的共定位。(d日)感兴趣区域（由α→ω箭头定义）内的典型共焦显微照片和共定域轮廓。(**e（电子）**)柱描述了GFP-LC3和LAMP-2之间共定位的百分比，在每个实验条件下至少50个细胞中进行量化（平均值±S.E.M。，n个=3,^**P（P）*<0.05). (f）GFP-LC3的百分比^真空细胞（平均值±S.E.M。，n个=3,^**P（P）*<0.05; 不重要）。(克,小时). SIR2.1过度表达对*秀丽线虫*. (克)WT或SIR2.1的代表性图像-过度表达(*锗In3*基因型；见材料和方法）*秀丽线虫*显示DsRed:：LGG1点的细胞。(小时)列描述了DsRed:：LGG1的平均像素强度（平均值±S.E.M。，n个=3,^**P（P）*< 0.05)

图2
白藜芦醇（Resv）触发自噬空泡化，不能抑制自噬体与溶酶体的融合。(一)检测野生型（WT）HCT 116中Resv诱导的自噬空泡和EX527的调节。用编码GFP-LC3的质粒转染细胞24小时，并在没有或存在100个μM Resv和/或100μM EX527。细胞百分比显示GFP-LC3在细胞质斑点（GFP-LC2）中积聚^真空)报告（平均值±S.E.M。，n个=3,^**P（P）*<0.05). (b条)免疫印迹法测定Sirtuin-1（Sirt-1）、Lys382乙酰化p53（p53 Ac Lys381）、总p53以及LC3成熟度的水平。监测甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的丰度，以确保车道的负荷相等。这些数据代表了三个独立的实验。频带旁边的数字表示MW（kDa）。(**c（c）**–**e（电子）**)巴非霉素A1（BafA1）对Resv诱导的自噬的影响。表达GFP-LC3的HeLa细胞用Resv和/或BafA1处理6 h（除非另有说明），然后处理以评估GFP-LC2和LAMP-2之间的共定位。面板中显示了典型的共焦显微照片**c（c）**，以及感兴趣区域内的同位化轮廓（由α→ω箭头定义）。(d日)柱显示了GFP-LC3和LAMP-2之间的共定位百分比（平均值±S.E.M。，^**P（P）*<0.05），在每个实验条件下至少50个细胞中定量。(**e（电子）**)GFP-LC3再分布动力学通过常规荧光显微镜定量（平均值±S.E.M。，n个=3,^**P（P）*<0.05). (**（f）**)LC3在用Resv和/或leupeptin（Leu）处理的WT HCT 116中成熟指定时间。对GAPDH水平进行了评估，以确保车道荷载相等。数据是三个独立实验的代表。波段旁边的数字表示MW（kDa）。(克,小时)Sirt-1敲除对Resv诱导的自噬的影响。转染有所示siRNAs的WT HCT 116细胞用表达GFP-LC3的质粒重新转染24小时，然后在有或无100μM白藜芦醇再维持6小时(克)列描述了GFP-LC3的百分比^真空细胞（平均值±S.E.M。，n个=3,^**P（P）*<0.05). 免疫印迹法测定Lys382乙酰化的Sirt-1、p53（Ac-Lys382 p53）、总p53和LC3I/II的丰度。GAPDH水平显示为车道等载的控制。(小时)三个独立实验的代表。波段旁边的数字表示MW（kDa）。(我)Resv诱导自噬及其对SIRT-2.1的依赖性*C.秀丽。*100的影响μ在野生动物或*sir-2.1（ok434）*表达DsRed:：LGG-1转基因的缺失突变体。列描述了DsRed:：LGG1的平均像素强度（平均值±S.E.M。，n个=3,^**P（P）*<0.05)

图3
Sirtuin-1（Sirt-1）在饥饿诱导的自噬中的作用。(一,b条)通过营养剥夺诱导癌细胞自噬的Sirt-1要求。用GFP-LC3编码结构转染野生型（WT）HCT 116细胞24小时，然后在无营养（NF）条件下额外培养6小时，或用1μ雷帕霉素（Rapa），2.5μM膜霉素（Tun），30μ存在或不存在100μM EX527的M环吡氟菊酯-α（Pif-α）(一). (b条)或者，用对照或Sirt-1缺失siRNA转染WT HCT 116细胞，然后用表达GFP-LC3的质粒转染24小时，然后在自噬诱导条件下培养，如一在细胞质斑点（GFP-LC3）中表现出GFP-LC2蓄积的细胞百分比^真空)报告（平均值±S.E.M。，n个=3,^**P（P）*<0.05). (**c（c）**)的要求*秀丽线虫*Sirtuin-1同源基因，SIR-2.1，用于饥饿诱导的自噬。对野生动物和*sir-2.1（ok434）*表达DsRed:：LGG-1转基因的缺失突变体随意（AL），在饮食限制（DR）条件下生长，或用2μg/ml Tun或1μg/ml Rapa。列显示DsRed:：LGG1的平均像素强度（平均值±S.E.M。，n个=3,^**P（P）*<0.05). (d日)WT和*第53页*^−/−用指示的siRNA转染HCT 116细胞，用GFP-LC3编码质粒再转染24小时，然后在对照或饥饿条件下再培养6小时。列描述了GFP-LC3的百分比^真空细胞（平均值±S.E.M。，n个=3,^**P（P）*<0.05). (**e（电子）**)内源性p53和赖氨酸乙酰化蛋白的免疫沉淀。将所示基因型的HCT 116细胞在饥饿条件下培养或用70 nM曲古抑菌素（TSA，乙酰化阳性对照）处理6 h，然后免疫沉淀p53或赖氨酸乙酰化蛋白，免疫印迹检测Lys382乙酰化的p53（Ac-Lys382 p53）、总p53或ATG7。或者，对总蛋白进行ATG7丰度和LC3成熟度分析。测定甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）水平以监测车道的等负荷。结果代表了三个独立的实验。波段旁边的数字表示MW（kDa）

图4
Sirtuin-1依赖性自噬有助于人类癌细胞的抗应激能力。(一,b条)代谢应激诱导的细胞死亡通过Sirtuin-1（Sirt-1）的敲除或抑制而增加。用指示的siRNA转染野生型（WT）HCT 116细胞(一)或用100μM EX527和/或1μ雷帕霉素（Rapa）(b条)并经受代谢应激（在无营养、低氧条件下培养）48小时。然后用线粒体跨膜电位（Δψ）对细胞进行染色_米)-敏感染料DiOC₆（3）和活性染料碘化丙啶（PI）。黑色和白色柱表示百分比（平均值±S.E.M。，n个=3,^**P（P）*<0.05）₆(3)^低的/PI公司⁻（死亡）和DiOC₆(3)^低的/PI公司⁺（死亡）细胞

图5
Sir-2.1的寿命延长效应需要自噬*秀丽线虫*. (一)Sir-2.1过度表达带来的长寿(*锗In3*基因型）取决于Bec-1的表达（寿命值：野生型，WT，对照平均值14.6±0.7，最大值26.0；*锗In3*平均值19.5±1.1，最大值33.0；*bec-1（RNAi）*平均值13.1±1.2，最大值22.0；*geIn3；bec-1（RNAi）*平均值14.7±1.1，最大值27.0）。(b条)SIR-2.1或Bec-1的耗尽抑制了吡嗪酰胺酶/烟酰胺酶PNC-1过度表达所带来的寿命（寿命值：WT对照组平均值14.6±0.7，最大值26.0；前任[*pnc-1型*（+）]平均18.1±1.0，最大29.0；前任[*pnc-1型*(+)]*;sir-2.1（ok434）*平均12.9±1.1，最大24.0；前任[*pnc-1型*(+)]*;bec-1（RNAi）*平均14.0±1.2，最大23.0）。(**c（c）**)Bec-1缺乏会抑制100倍治疗带来的寿命μg/ml白藜芦醇（Resv）（寿命值：WT对照组平均值14.6±0.7，最大值26.0；Resv组生长的WT平均值16.2±1.0，最大值29.0；*bec-1（RNAi）*平均值13.1±1.2，最大值22.0；*bec-1（RNAi）*Resv平均值为12.9±1.2，最大值为24.0）。(d日)耗尽*秀丽线虫*p53直向同源物Cep-1不能提高Sir-2.1过表达所赋予的寿命（寿命值：WT对照组平均14.6±0.7，最大26.0；*锗In3*平均值19.5±1.1，最大值33.0；*geIn3；cep-1（RNAi）*平均18.8±1.2，最大32.0）。在所有面板中，存活线虫的百分比都是根据年龄（天）绘制的

图6
Sirtuin-1在自噬中作用的示意图模型。在人类细胞和*秀丽线虫*热量限制、白藜芦醇或其上游激活物吡嗪酰胺酶/烟酰胺酶的过度表达诱导Sirtuin-1激活(*多氯联苯-1*)刺激自噬。这对线虫有延长寿命的作用，就像击倒线虫一样*秀丽线虫*p53同源Cep-1和雷帕霉素给药，均通过Sirtuin-1非依赖性途径触发自噬

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中的注释

通过sirtuins和自噬将热量限制与长寿联系起来：TOR的任何作用。
布拉戈斯克隆尼MV。布拉戈斯克隆尼MV。细胞死亡疾病。2010;1（1）：e12。doi:10.1038/cddis.2009.17。细胞死亡疾病。2010. PMID：21364614 免费PMC文章。没有可用的摘要。

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