Ischaemia-induced retinal neovascularisation and diabetic retinopathy in mice with conditional knockout of hypoxia-inducible factor-1 in retinal Müller cells

doi:10.1007/s00125-011-2081-0

。2011年6月；54(6):1554-66.

doi:10.1007/s00125-011-2081-0。 Epub 2011年3月1日。

视网膜Müller细胞缺氧诱导因子-1条件性敲除小鼠缺血诱导的视网膜新生血管和糖尿病视网膜病变

M林¹, Y Chen先生, J Jin（金）, 胡彦宏, K K Zhou（K K周）, M Zhu先生, Y-Z乐, J Ge公司, R S约翰逊, J-X马

附属公司

PMID： 21360191
预防性维修识别码：项目经理6592825
内政部： 2007年10月7日/00125-011-2081-0

视网膜Müller细胞缺氧诱导因子-1条件性敲除小鼠缺血诱导的视网膜新生血管和糖尿病视网膜病变

M林等。糖尿病学。 2011年6月。

。2011年6月；54(6):1554-66.

doi:10.1007/s00125-011-2081-0。 Epub 2011年3月1日。

作者

M林¹, Y Chen先生, J Jin（金）, 胡彦宏, K K Zhou（K K周）, M Zhu先生, Y-Z乐, J Ge公司, R S约翰逊, J-X马

附属

¹美国俄克拉何马州俄克拉荷马市俄克拉荷玛大学健康科学中心生理学系。

PMID： 21360191
预防性维修识别码：项目经理6592825
内政部： 2007年10月7日/00125-011-2081-0

摘要

目的/假设：众所周知，视网膜Müller细胞会产生炎症和血管生成细胞因子，在糖尿病视网膜病变中发挥重要作用。缺氧诱导因子（HIF）-1已被证明在视网膜炎症和新生血管形成中起着至关重要的作用。我们试图使用条件HIF-1α（也称为Hif1a）敲除（KO）小鼠来确定Müller细胞衍生的HIF-1在氧诱导视网膜病变（OIR）和糖尿病视网膜病变中的作用。

方法：通过在Müller细胞中表达环化重组酶（cre，也称为P1_gp003）的小鼠与漂浮的Hif-1α小鼠杂交产生条件型Hif-1 a-KO小鼠，并分别用于OIR和链脲佐菌素诱导的糖尿病诱导视网膜新生血管和炎症。通过免疫印迹和免疫组织化学检测HIF-1α、促血管生成和促炎症因子的丰度。通过血管造影观察视网膜新生血管，并通过视网膜前核计数进行量化。通过白细胞沉积和血管渗漏评估视网膜炎症。

结果：虽然Hif-1αKO小鼠的视网膜中Hif-1α水平显著降低，但在正常条件下，它们没有表现出明显的组织学或视觉功能异常。与野生型小鼠相比，患有OIR的Hif-1αKO小鼠表现出血管内皮生长因子（VEGF）和细胞间黏附分子（ICAM）-1的过度分泌减弱，血管渗漏减少，视网膜新生血管减少。在糖尿病条件下，Müller细胞中Hif-1α的破坏减弱了视网膜血管渗漏和粘附白细胞的增加，以及VEGF和ICAM-1的过度生成。

结论/解释：Müller细胞衍生的HIF-1α是视网膜新生血管、血管渗漏和炎症（糖尿病视网膜病变的主要病理变化）的关键介质。因此，Müller细胞衍生的HIF-1α是糖尿病视网膜病变很有希望的治疗靶点。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益的双重性作者声明，这份手稿不存在利益的双重性。

数字

**图1。条件培养的Müller原代细胞中HIF-1α和VEGF的丰度*Hif-1α*KO小鼠。**
一GS（红色）在原代Müller细胞和(b条)GS染色与DAPI（蓝色）融合。**c（c）**GS阴性对照，其中省略了一级抗体。**d、 g、j、m**野生型（WT）原代Müller细胞中HIF-1α（红色信号）的免疫染色*Hif-1α*KO小鼠在常氧或缺氧条件下。**e、 h、k、n**上述细胞核染色(**d、 g、j、m**)带DAPI（蓝色）和(**f、我，我，我**)合并的图像。箭头表示Müller细胞HIF-1α受损。比例尺50μm。第页对原代Müller细胞中的HIF-1α进行Western blot分析，HIF-1 a水平通过密度测定进行量化，并通过β-肌动蛋白水平进行归一化（以下量化中未提及）。HIF-1α在Müller细胞中显著降低*Hif-1α*KO小鼠（黑条）在常氧条件下达到WT（白条）细胞的57%。缺氧时，HIF-1α水平*Hif-1α*KO细胞占野生型细胞的49%。q个VEGF的蛋白质印迹分析和定量。VEGF水平在原代Müller细胞中显著降低*Hif-1α*缺氧条件下的KO小鼠。值(**p、 q个**)是平均值±SEM；n个=3; *第页<0.05和**第页<0.01

**图2。视网膜的形态和功能*Hif-1α*KO小鼠。**
一12周龄野生型（WT）和(b条)*Hif-1α*苏木精和伊红染色的KO小鼠。ONL，外核层；INL，内核层；GCL，神经节细胞层。比例尺50μm。**c（c）**WT（白条）和*Hif-1α*KO（黑条）小鼠；n个=5.d日WT和WT的视网膜荧光素血管造影(**e（电子）**)*Hif-1α*17岁的KO小鼠。比例尺100μm。**（f）**视网膜血管密度的量化；n个=8.克Scotopic和(小时)12周龄时记录明视ERG，测量A波和B波振幅；n个=9.值(**c、 f、g、h**)是平均值±SEM，第页>0.05

**图3。视网膜HIF-1α蛋白水平降低*Hif-1α*KO小鼠。**
**a–f**野生型（WT）和*Hif-1α*KO小鼠在正常条件下或(**克–升**)OIR位于P17。**a、 d、g、j**DAPI核染色（伪红色）；(**b、 e、h、k**)HIF-1α染色（绿色）；(**c、 f、i、l**)合并的图像。比例尺50μm。ONL，外核层；INL，内核层；GCL，神经节细胞层。米P17处HIF-1α的Western blot分析。用HIF-1α特异性抗体和β-肌动蛋白特异性抗体对来自每只小鼠的相同数量（20μg）的视网膜蛋白进行印迹。n个HIF-1α的丰度在*Hif-1α*KO小鼠（黑条）与WT小鼠（白条）在正常或缺氧条件下的比较。数值为平均值±SEM；n个=6; *第页<0.05和**第页<0.01

**图4。视网膜中VEGF过度生成减弱*Hif-1α*KO小鼠。**
**a、 d日**野生型（WT）血管内皮生长因子（红色）的免疫组织化学染色*Hif-1α*KO小鼠常氧或(**g、 j个**)在P17岁时出现OIR。**b、 e、h、k**GS染色（绿色）和(**c、 f、i、l**)如上所述，将VEGF和GS染色与DAPI染色（蓝色）相结合(**a、 d、g、j**). 比例尺50μm。GCL，神经节细胞层；INL，内核层；ONL，外核层。米使用每只小鼠20μg视网膜蛋白，通过western blot分析测定视网膜VEGF。n个western blot密度测定显示VEGF在*Hif-1α*OIR的KO小鼠（黑条）比OIR的WT小鼠（白条）。**o（o）**还用ELISA测定了视网膜VEGF水平，表明VEGF的过度生成在*Hif-1α*缺氧条件下的KO小鼠。值(**n、 o个**)是平均值±SEM；n个=6; *第页<0.05和**第页<0.01

**图5。减少ICAM-1过多，减少视网膜血管渗漏*Hif-1α*具有OIR的KO小鼠。**
一在彻底灌注后解剖视网膜，以清除血管中的血液。ICAM-1和(**c（c）**)在正常条件下或OIR条件下，使用来自P17岁每只小鼠的20μg视网膜蛋白，通过western blot分析测定白蛋白。b条ICAM-1和(d日)白蛋白水平通过密度测定进行量化，显示ICAM-1和白蛋白在*Hif-1α*OIR的KO（黑条）小鼠比OIR的野生型（WT；白条）小鼠。值(**b、 d日**)是平均值±SEM；n个=6; *第页<0.05和**第页<0.01

**图6。改善缺血诱导的视网膜新生血管*Hif-1α*具有OIR的KO小鼠。**
**a–d**用野生型高分子量荧光素-dextran（WT）进行荧光素血管造影(**a、 c（c）**)和*Hif-1α*KO公司(**b、 d日**)P17岁OIR小鼠。全安装视网膜的视网膜血管造影显示*Hif-1α*OIR的KO小鼠比OIR的WT小鼠。箭头表示新生血管簇。比例尺100μm(**a、 b条**)，50微米(**c、 d日**)。**e（电子）**OIR治疗的WT和(**（f）**)*Hif-1α*17岁的KO小鼠。箭头表示新生血管中的视网膜前核。比例尺50μm。克通过计算眼睛横截面上的视网膜前核来量化新生血管。视网膜前核明显减少*Hif-1α*KO比具有OIR的WT小鼠。数值为平均值±SEM；n个=4; *第页<0.05

图7。糖尿病诱导的HIF-1α、VEGF和ICAM-1视网膜水平升高，以及野生型（WT）和*Hif-1α*KO小鼠。WT和*Hif-1α*对患有2个月糖尿病的KO小鼠进行灌流并解剖视网膜。
一HIF-1α的Western blot分析(b条)血管内皮生长因子(**c（c）**)ICAM-1和(d日)用同样数量的每只小鼠视网膜蛋白进行白蛋白测定。通过密度测定定量的HIF-1α、VEGF、ICAM-1和白蛋白水平，以及通过β-肌动蛋白水平归一化的结果，在糖尿病患者中显著降低*Hif-1α*与糖尿病WT（白条）小鼠相比，KO（黑条）小鼠。条形图中的值为平均值±SEM；n个=5; *第页<0.05和**第页<0.01

**图8。白细胞增多减少*Hif-1α*1型糖尿病KO小鼠模型。**
一非糖尿病小鼠(b条)糖尿病野生型（WT）小鼠和(**c（c）**)糖尿病*Hif-1α*在链脲佐菌素诱导的糖尿病发病后2个月，用KO小鼠进行白细胞计数。通过灌注去除循环白细胞后，用FITC-结合刀豆球蛋白A对视网膜血管中的粘附白细胞（箭头所示）进行染色。在荧光显微镜下观察视网膜扁平支架中的视网膜血管和白细胞。比例尺50μm。d对视网膜血管中的粘附白细胞进行计数和平均，显示糖尿病（DM）*Hif-1α*KO小鼠的白细胞明显少于糖尿病WT小鼠。数值为平均值±SEM；n个=5, **第页<0.01

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1. Rey S，Semenza GL.低氧诱导因子-1依赖的血管形成和血管重塑机制。2010年心血管研究；86:236–242.-项目管理咨询公司-公共医学
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