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.2011年4月1日；286(13):10939-49.
doi:10.1074/jbc。M110.216093。 Epub 2011年2月1日。

eIF2磷酸化促进抑制性上游ORF的核糖体旁路以增强CHOP翻译

拉克希米红宫 1, 托马斯·德·贝尔德, 罗纳德·C·韦克
附属机构

eIF2磷酸化促进抑制性上游ORF的核糖体旁路以增强CHOP翻译

拉克希米红宫等人。 生物化学杂志. .

摘要

为了应对不同的环境胁迫，真核生物起始因子-2（eIF2）的磷酸化迅速减少蛋白质合成，从而降低能量消耗并促进基因表达的重新编程，以修复应激损伤。作为基因表达变化的核心，eIF2磷酸化还增强了ATF4的翻译，ATF4是受综合应激反应（ISR）影响的基因的转录激活物。ISR增加了对缓解压力或触发凋亡至关重要的基因的表达。一个ISR靶基因编码转录调节因子CHOP，CHOP的积累对应激诱导的凋亡至关重要。在本研究中，我们发现eIF2磷酸化通过一种机制诱导CHOP的优先翻译，该机制涉及位于CHOP mRNA 5'-先导的单个上游ORF（uORF），uORF的翻译是阻止下游CHOP编码区翻译的屏障。应激期间eIF2磷酸化的增强促进了uORF的核糖体旁路，因为它的起始位点环境较差，相反，它允许扫描核糖体翻译CHOP。这种新的翻译控制机制解释了CHOP的表达和细胞的命运如何与磷酸化eIF2水平和应激损伤紧密相关。

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数字

图1。
图1。
eIF2α磷酸化增加CHOP公司表达对内质网应激的反应。 A类，野生型MEF细胞(重量)和表达非磷酸化eIF2α-S51A的突变细胞(A/A公司)如图所示，用内质网应激剂thapsigargin处理6小时，或无应激处理（0小时）。制备裂解物，并使用特异识别每个蛋白的抗体通过免疫印迹分析测定磷酸化eIF2α、总eIF2 a、ATF4、CHOP和β-肌动蛋白的水平。B类，从野生型和A/A公司用thapsigargin处理MEF细胞6小时（应激）或无应激，以及自动变速箱4和CHOP公司用qRT-PCR测定mRNA。
图2。
图2。
两者自动变速箱4和CHOP公司在内质网应激期间，mRNA优先与大的多聚体相关。将野生型MEF细胞暴露于内质网应激剂thapsigargin中6 h（应激）或不应激处理。然后在10–50%蔗糖梯度下通过离心分析细胞裂解物，并在254nm处通过吸光度测量轮廓。这个顶部面板突出显示40 S和60 S核糖体亚单位、80 S单体和多体。从蔗糖梯度收集的组分中制备总RNA自动变速箱4,CHOP公司和肌动蛋白编码转录物存在于内质网应激产生的七个组分中的每一个(强调)或未处理的细胞(没有压力)通过qRT-PCR测定。值表示为直方图对于每个分数。每次测量都要进行三个独立的实验，每个实验都要标明S.D。这个顶部面板是三个独立实验的代表。
图3。
图3。
5′-领导CHOP公司mRNA含有uORF，足以对eIF2～P进行翻译控制。 A、 顶部面板，对内源性CHOP公司和CHOP-Luc公司使用由野生型MEF细胞制备的RNA表达P（P）TK公司-CHOP-Luc公司用ER应激剂thapsigargin（+）或无应激剂（-）治疗的报告者。使用1.2%琼脂糖凝胶电泳分离DNA产物并进行可视化，在正确的。A类,底部面板，小鼠5′-先导序列CHOP公司信使核糖核酸与盒表示uORF和CHOP-荧光素酶融合的编码区。分析中突变的残留物CHOP公司显示平移控制在下面盒子。这个粗体箭头指示的转录起始位置CHOP公司通过5′-RACE产物测序确定的基因。在uORF上游的指定位置插入干环结构或120-bp段。B类，由uORF编码的多肽序列CHOP公司来自不同脊椎动物的mRNA。uORF多肽序列来自来自所示的CHOP公司直系亲属，包括人类（GenBankTM（TM）登录号BC003637）、小鼠（BC013718）、大鼠（BC100664）、仓鼠（M29238）、猪（AK346731）、熊（GW278660）、奶牛（BC122721）、绵羊（DY499855）、狗（DN431044）、青蛙热带非洲爪蟾（BC153679）和鱼类达尼奥雷里奥（BC134052）。每个uORF编码的多肽残基的数量如下所列。一致意见中列出了uORF序列中保守的残基，其中不变残基位于大写字母和那些保存在小写字母。C、 CHOP公司通过双荧光素酶分析测定内质网应激反应中的翻译控制。这个P（P）TK公司-CHOP-Luc公司记者和雷尼利亚荧光素酶质粒作为内部对照，转染到野生型MEF细胞中(重量)或A/A公司表达eIF2α-S51A的细胞，并用thapsigargin处理(强调)或者没有压力。这个P（P）TK公司-CHOP-Luc公司报告者包含对应于整个5′-先导的cDNA序列CHOP公司mRNA，与荧光素酶报告基因一起说明。每个测量值都进行了三个独立的实验，相对值用直方图表示，并标明S.D。同时CHOP-Luc公司mRNA通过qRT-PCR测定，报告转录物的相对值以直方图表示误差线代表S.D。
图4。
图4。
uORF抑制CHOP公司翻译。图示的野生型和突变型P（P）TK公司-CHOP-Luc公司将报告者转染到野生型MEF细胞中，并对其进行双荧光素酶分析(强调)或者没有压力。的突变版本CHOP-Luc公司报告器包括在uORF上游插入干环结构，以及X（X）表示单独或组合替代AGG的uORF的ATG1和ATG2。此外CHOP-Luc公司用qRT-PCR测定mRNA。每个测量值都进行了三个独立的实验，相对值用直方图表示，并与指示的S.D。
图5。
图5。
CHOP-Luc mRNA在内质网应激反应中优先与大多聚体相关。野生型MEF细胞转染了野生型的P（P）TK公司-CHOP-Luc公司报告者或ATG1和ATG2（ΔATG1 andΔATG2）均发生突变的版本。转染细胞暴露于thapsigargin(强调)6小时或无应力处理。然后通过蔗糖梯度离心分析细胞裂解物，并通过254nm处的吸光度监测组分(顶部面板)具有指示的40 S和60 S核糖体亚单位、80 S单体和多体。总RNA由组分制备CHOP-Luc公司从内质网应激中获得的七个组分中的每一个组分中存在的mRNA(强调)或未处理的细胞(没有压力)通过qRT-PCR测定。进行了三个独立的实验，并说明了每个分数的测量值以及S.D.值。
图6。
图6。
启动uORF翻译的强启动密码子上下文阻止抑制元件对内质网应激的旁路反应。野生型和指示的突变版本P（P）TK公司-CHOP-Luc公司将报告者转染到野生型MEF细胞中，并对其进行双荧光素酶分析(强调)或者没有压力。突变版本包括uORF编码终止密码子的替换（TGA到GGA），导致uORF的扩展，使其在帧外与吕克编码区域。此外，在没有ATG1的情况下，uORF的ATG2被一个强大的Kozak上下文所取代。或者，在uORF上游插入一个没有起始密码子和强预测二级结构的120-核苷酸片段。相对数量CHOP-Luc公司mRNA也通过qRT-PCR测定。每个分析都进行了三个独立的实验，相对值用S.D.表示。
图7。
图7。
uORF的羧基末端部分抑制CHOP公司翻译。 A、 P（P）TK公司-uORF-Luc公司编码uORF和萤火虫荧光素酶之间帧内融合的质粒被转染到野生型MEF细胞中，并对每个细胞进行双报告分析。这个P（P）TK公司-uORF-Luc公司如图所示，质粒包含全长uORF或包含密码子24-34、14-34或14-23缺失的版本。同时CHOP-Luc公司mRNA也通过qRT-PCR测定。对每个报告构造进行了三个独立的实验，并用S.D.表示了每个构造的相对值。B类使用识别萤火虫荧光素酶的抗体进行免疫印迹分析，确定包含全长uORF或指示缺失突变体的uORF-Luc融合蛋白的水平。还测量了肌动蛋白水平，以使裂解产物正常化。作为对照，用不含载体或只表达萤火虫荧光素酶的载体的MEF细胞制备的裂解物进行免疫印迹分析。C类，说明了P（P）TK公司-CHOP-Luc公司将报告者转染到野生型MEF细胞中，在内质网应激或无应激期间进行双荧光素酶分析。突变版本包括将uORF的密码子24（AGA）突变为TGA，以生成uORF缩短版本的荧光素酶报告子。此外，如图所示，uORF的缩写版本与强大的Kozak上下文相结合。的相对水平CHOP-Luc公司mRNA也通过qRT-PCR测定。分别进行了三个独立的实验，并表示了相对值和S.D。
图8。
图8。
eIF2α的磷酸化促进抑制性uORF的核糖体旁路，增强CHOP公司编码区域。在没有压力的情况下，eIF2～P较低，eIF2-GTP水平较高。建议核糖体结合5′端CHOP公司mRNA和扫描核糖体翻译uORF，导致翻译延长或终止受阻，以及低翻译CHOP公司编码区域。在应激期间，存在强健的eIF2～P，可以减少eIF2-GTP到eIF2-GDP的交换，这是为了减少由于启动密码子上下文不佳而在uORF处的翻译启动。因此，扫描核糖体绕过抑制性uORF，转而翻译CHOP公司编码区，具有一个具有强烈Kozak共识的起始密码子。
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