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.2011年1月21日；144(2):253-67.
doi:10.1016/j.cell.2010.12.018。

RalB和外囊通过自噬体组装的直接激活介导细胞饥饿反应

布莱恩·奥博德曼 1, 安东尼·奥维达尔, 子陵城, 罗莎琳·R·拉姆, 欧一宏, Etienne Formstecher公司, Mekhala Maiti公司, C克莱顿·哈泽列特, 埃里克·M·沃森, 玛丽亚·巴拉基列娃, 雅克·卡莫尼斯, 查尔斯·伊曼, 贝斯·莱文, 迈克尔·A·怀特
附属公司

RalB和外囊通过直接激活自噬体组装体介导细胞饥饿反应

布莱恩·奥博德曼等。 单元格. .

摘要

对哺乳动物细胞中大分子自噬的研究表明，诱导、囊泡成核和膜伸长复合物是驱动自噬体生物发生的关键信号中间体。这些成分是如何被招募到新生自噬体的，目前尚不清楚，尽管人们对抑制自噬的信号机制知之甚少，但可以促进自噬的阳性诱导信号的性质仍然是未知的。我们发现Ras-like小G蛋白RalB定位于新生的自噬体，在营养缺乏时被激活。营养缺乏诱导的自噬细胞增多需要RalB及其效应物Exo84，而RalB的激活足以促进自噬体的形成。通过与Exo84直接结合，RalB诱导在外囊上组装催化活性的ULK1和Beclin1-VPS34复合物，这是隔离膜形成和成熟所必需的。因此，RalB信号是对营养限制的一种主要适应性反应，通过核心囊泡成核机制的动员直接参与自噬细胞增生。

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数字

图1
图1。Ral-包囊复合体与自噬机制的物理和功能相互作用
A-G：胞外囊亚基与自噬蛋白相互作用。所示蛋白在HEK-293细胞中过表达，然后用抗体免疫沉淀到指定标签。免疫沉淀物与（A，B）GFP-Sec3共沉淀；（C，D）红色标志；（E，F）标记-ATG14L；和（G）GFP-ATG5，如图所示。全细胞裂解物（WCL）、免疫沉淀（IP）。高：内源性Sec8复合物含有ATG5-12共轭物。用抗Sec8抗体从HEK-293细胞中免疫沉淀内源性胞外复合物，并用抗ATG5抗体分析ATG5/ATG12结合物（Sec8 IP）的共沉淀。抗-Myc免疫沉淀物用作阴性对照（Myc IP）。显示了两个独立的实验。显示了输入的全细胞非变性裂解物中检测的蛋白质的表示（WCL）。我：抑制Ral信号阻断LC3对氨基酸饥饿的反应。转染Myc-Rip（RBD）Hela细胞48小时后，在DMEM或EBSS中再培养4小时，如图所示。分别使用抗Myc和抗LC3抗体通过免疫荧光检测Myc-Rip（RBD）和LC3。载体控制细胞与未转染细胞相似。比例尺20μm。记者：抑制Ral信号阻断LC3对病原体感染的反应。如图所示，用单体RFP-LC3和Myc-Rip（RBD）或空载体对照转染Hela细胞。转染后48小时，用鼠伤寒沙门菌-GFP 1小时，然后在感染后3小时选择细胞内沙门氏菌。使用各自的荧光融合物对内部沙门氏菌和LC3进行可视化。方框所示亚细胞区域的高倍放大显示在右侧的面板中。虚线表示在饱和曝光中可见的细胞边界。比例尺10μm。克：EBSS处理的细胞在单细胞分辨率下对应于Myc-Rlip（RBD）（抗-Myc）和内源性LC3（抗-LC3）的总荧光强度，如（I）所示（n=82，R2=0.7722).左侧：RalB足以诱导LC3穿孔的积聚。表达单体RFP-LC3和GFP-ATG5或GFP-RalB的Hela细胞如图所示。比例尺10μm。男：对（L）中处理的细胞中的mRFP-LC3点进行定量。mRFP-LC3点状细胞/细胞的分布显示为盒须图。方框的三个带表示第25（下）、第50（中）和第75（上）四分位数。晶须延伸至四分位间距的1.5倍或最高或最低点，以较短者为准。+表示平均值。使用学生的t检验计算P值。编号：表达RalB（23V）或转染载体对照的HBEC3-KT细胞在含有50μM氯喹（CQ）的生长培养基中培养4小时，以通过自噬体阻止LC3周转，然后用抗LC3抗体检测内源性LC3。操作：RalB足以诱导自噬通量。如图所示，在生长培养基或无氨基酸的EBSS（厄尔平衡盐溶液）中培养HBEC3-KT细胞4小时，加入或不加入50μM氯喹（CQ），以防止LC3在自噬体中的周转。用抗LC3抗体进行免疫荧光，并对LC3点进行定量。数据表示为平均+/-SEM。电话：将转染Flag-RalB（G23V）或载体对照的HBEC3-KT细胞的全细胞裂解物置于含有50μM氯喹（CQ）的培养基中培养4小时，分析LC3（I）和LC3（II）的相对积累。β-actin显示为一种负荷控制。另见表S1。
图2
图2。RalB和包含Exo84的外囊亚复合物对于氨基酸饥饿诱导的自噬是必需的
答：RalB缺失抑制GFP-LC3点的积聚。通过siRNA转染，稳定表达GFP-LC3的Hela细胞中的指示蛋白被耗尽。转染96小时后用GFP荧光成像细胞。比例尺10μm。B类：Sec5和Exo84选择性参与GFP-LC3突起的积累。对（A）中处理的细胞中的GFP-LC3点进行定量。GFP-LC3点状细胞/细胞的平均分布以条形图显示，数据以平均+/-SEM表示。P值通过单向方差分析和Dunnett多重比较测试计算。抄送：GFP-LC3斑点的抑制与LC3蛋白的积累相关。量化如（A）所述处理的细胞中GFP-LC3的平均总强度。平均总GFP强度的分布以条形图显示，数据以平均+/-SEM表示。P值通过单向方差分析和Dunnett多重比较测试计算。医生：外囊亚单位的一个子集限制了GFP-LC3点的积累。所示的siRNA按照（B）进行评估。电子邮箱：RalB缺失抑制LC3-脂质结合物的积累。测定用所示siRNA转染的稳定表达GFP-LC3的HBEC3-KT细胞的全细胞裂解物中GFP-LC3（I）和GFP-LC3（II）的相对积累。β-actin显示为一种负荷控制。转染后96小时显示siRNA-介导的靶点缺失（右图）。传真：RalB参与内源性LC3点的积累。通过siRNA转染去除Hela细胞中的指示蛋白。转染后96小时，细胞在无氨基酸的EBSS中孵育4小时。内源性LC3通过抗LC3免疫荧光成像。比例尺10μm。德国：对（E）中处理的细胞内内源性LC3点进行定量。LC3点状细胞/细胞的平均分布显示为条形图，数据表示为平均+/-SEM。P值通过单向方差分析计算，然后进行Dunnett多重比较测试。另请参见图S1。
图3
图3。Native RalB与自噬机制共存
答：Beclin1和RalB在细胞自噬诱导前后共定位。如图所示，在新鲜生长介质或EBSS中培养90分钟，HBEC30-KT细胞中的Beclin1（抗Beclin 1）和RalB（抗RalB）的内源性免疫荧光。虚线表示单元格轮廓。比例尺10μm。B-D：RalB与自噬体生物发生的早期和晚期标记物共定位。HBEC30-KT细胞转染（B）GFP-2X-Fyve；（C） GFP-ATG5；和（D）GFP-LC3。细胞在EBSS中孵育（B）30分钟；（C） 90分钟；或（D）3小时。显示GFP荧光和内源性RalB（抗RalB）免疫荧光。底部面板中显示了方框指示的10μm×10μm区域的高倍率。比例尺10μm。电子邮箱：ATG5和RalB被募集到初始隔离膜形成的位点。感染HBEC30-KT细胞的ATG5（anti-ATG5）和RalB（anti-RalB）内源性免疫荧光鼠伤寒沙门菌-GFP。细胞暴露于鼠伤寒沙门菌-GFP治疗1小时，然后在感染后3小时针对细胞外沙门氏菌进行抗生素选择。比例尺2μm。传真：SenV感染选择性地改变RalB与RalA的亚细胞分布。HBEC3-KT细胞中RalA（anti-RalA）和RalB（anti-RalB）的内源性免疫荧光模拟感染或感染仙台病毒5小时。比例尺10μm。德国：SenV感染诱导内源性RalB/ATG5-12复合物的积累。用抗RalB抗体从模拟感染或仙台病毒感染的HBEC3-KT细胞中免疫沉淀内源性RalB复合物，并分析ATG5/ATG12结合物的共沉淀。
图4
图4。营养剥夺驱动Exo84/Beclin1复合物的组装
答：营养限制诱导Beclin1/Exo84相互作用并抑制Beclin1/Sec5相互作用。用标记的Beclin1和胞外表达构建物转染后48小时，HEK-293细胞在含有1×非必需氨基酸的DMEM、EBSS或EBSS中培养90分钟或4小时，如图所示。然后用针对特定标签的抗体对指示的蛋白质进行免疫沉淀。分析免疫沉淀物与Flag-Beclin1的共沉淀。全细胞裂解物（WCL）、免疫沉淀物（IP）。E、 传真：Beclin1（F123A）突变体与Exo84相互作用，但不与Sec5相互作用。如图（A-D）所示，与所示蛋白质进行共表达，即Co-IP。德国：内源性Beclin1/Exo84复合物积累是对营养剥夺的反应。从在EBSS（顶部面板）或DMEM（底部面板）中培养90分钟的HEK-293细胞中免疫沉淀内源性Beclin1，并分析Exo84（IP）的共沉淀。宿主物种匹配的非特异性IgG免疫沉淀物作为阴性对照。显示了输入的全细胞非变性裂解物中检测的蛋白质的表示（WCL）。高：Exo84和Sec5在不同的亚细胞隔室中富集。MDCK细胞中Sec5（抗Sec5）和Exo84（抗Exo84）的内源性免疫荧光。比例尺10μm。一、 记者：Exo84和Sec5可以将Beclin1募集到不同的亚细胞隔室。用（F）Flag-Beclin1和Myc-Exo84转染HEK-293细胞；（G） 标志-Beclin1和HA-Sec5。对所示融合标签进行免疫荧光。方框所示的10μm×10μm区域的高放大倍数如下图所示。比例尺10μm。另请参见图S2。
图5
图5。RalB通过直接RalB-Exo84效应器结合驱动Exo84/Beclin1复合物的组装
答：氨基酸缺失激活RalB。通过GST-Sec5-RBD介导的亲和纯化从在EBSS中孵育指定时间的HEK-293细胞中收集内源性GTP结合的RalA和RalB，并用特异性抗RalA和抗RalB抗体进行观察。RalA和RalB的标准化GTP加载指数计算如下拉尔（GTP）/总Ral生成散点图。B-F：RalB调节Beclin1/外囊-亚复合物相互作用。所示蛋白在HEK-293细胞中表达，并用抗体免疫沉淀到适当的标签上。如图所示，分析免疫沉淀物与Flag-Beclin1、Flag-RalB（23V）和内源性Sec8的共沉淀。全细胞裂解物（WCL）、免疫沉淀（IP）。德国：营养状况规定了不同的内源性RalB/效应器相互作用。将内源性RalB与来自在DMEM或EBSS中孵育90分钟的HEK-293细胞的抗RalB抗体免疫沉淀，如图所示，并分析Exo84、Sec5、ATG14L、UVRAG和ULK1的共沉淀。高：转染48小时后，HEK-293细胞在DMEM或EBSS中培养90分钟，如图所示。检测Flag-RalB免疫沉淀物是否与HA-Sec5共沉淀。通过将免疫沉淀Sec5除以总表达Sec5，然后将计算值归一化为DMEM条件，计算所示的归一化IP/输入比。我：Ral-inhibition诱导Exo84/Rubicon相互作用的积累。如（B-F）所示，与所示蛋白质进行共表达、共IP。
图6
图6。RalB表达驱动Exo84/Vps34和Exo84/ATG14L复合物的组装
A-F：VPS34和ATG14L/外囊亚复合物受营养限制和RalB激活调节。如图所示，表达所示蛋白的HEK-293细胞在DMEM或EBSS中培养90分钟。标记的外囊亚单位进行免疫沉淀，并与标记的VPS34和标记的ATG14L进行共沉淀分析。德国：RalB/Exo84效应器相互作用动员VPS34活性。如图所示，Hela细胞表达GFP-2X-Fyve以及RalB部分功能丧失突变体Flag-RalB（E38R）或Flag-Ral B（A48W）。高：对按（G）处理的细胞中的GFP-2X-Fyve点刺进行定量。GFP-2X-Fyve点刺/细胞的分布显示为盒状和须状图。使用学生的t检验计算P值。我：RalB（G23V）和RalB（G23V，E38R）足以诱导GFP-LC3斑点的积累，激酶死亡的ULK1（K46N）阻断了RalB（G23V）表达的增加。将稳定表达GFP-LC3的Hela细胞转染所示结构，然后通过所示标记的免疫荧光显示。GFP-LC3点状细胞/细胞的分布显示为盒须图。使用学生的t检验计算P值。
图7
图7。活性ULK1与Exo84相关
答：RalB诱导ULK1/Beclin1复合物形成。如图所示，在RalB（23V）表达后，分析ULK1免疫沉淀物与Flag-Beclin1的共沉淀。B类：ULK1/Exo84复合物受RalB调节。所示蛋白在HEK-293细胞中表达。对Myc-tagged Exo84进行免疫沉淀，并与HA-ULK1进行共沉淀分析。抄送：RalB诱导的ULK1/Beclin1复合物需要Exo84。首先用siControl或siExo84 siRNA转染HEK-293细胞，24小时后表达所示蛋白。如图所示，在RalB（23V）表达后，分析ULK1免疫沉淀物与Flag-Beclin1的共沉淀。天：ULK1/Sec5复合物在Ral抑制后积聚。如在（B）中那样进行与所指示的蛋白质的共表达、共-IP。电子邮箱：ULK1/Sec5复合物在营养缺乏时分解。如（B）所示，与所示蛋白质进行共表达，如所示，在DMEM或EBSS中额外培养90分钟。F类：氨基酸饥饿诱导Exo84与催化活性ULK1的关联。如图所示，对Exo84和Sec5复合物与ULK1的共沉淀和相关蛋白激酶活性进行了分析。德国：EBSS刺激的Exo84和Sec5沉淀物的归一化活性比通过MBP的除法计算32由（F）共沉淀的HA-ULK1信号并入P。高：RalB/外囊依赖性自噬动员的工作模型。另请参见图S3。
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中的注释

  • 将外囊作为自噬支架。
    FarréJC，Subramani S。 FarréJC等人。 单元格。2011年1月21日；144(2):172-4. doi:10.1016/j.cell.2011.01.005。 单元格。2011 PMID：21241888 免费PMC文章。

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