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。2011年4月21日；30(16):1855-67.
doi:10.1038/onc.2010.561。 Epub 2010年12月13日。

自噬对抑制细胞应激和BCR-Abl介导的白血病发生至关重要

B J奥特曼 1, S R雅各布斯, E F梅森, R D米查莱克, A N麦金太尔, 科罗拉多州J L, O伊尔卡耶娃, W Jia女士, Y-W He公司, J C Rathmell公司
附属公司

自噬对抑制细胞应激和BCR-Abl介导的白血病发生至关重要

B J奥特曼等。 癌基因。 。

摘要

造血细胞通常需要细胞外信号来维持新陈代谢和生存。相反，癌细胞可以表达构成活性的致癌激酶，如BCR-Abl，这些激酶可以独立于外源性生长因子促进这些过程。当细胞接收不到足够的生长信号或致癌激酶受到抑制时，葡萄糖代谢降低，自噬的自我消化过程升高，从而降解大量细胞质和细胞器。尽管自噬被认为可以为线粒体氧化代谢提供细胞内营养物质供应，并通过降解受损的细胞器或蛋白质聚集体来维持细胞内平衡，但其在生长因子剥夺或抑制致癌激酶方面的急性作用仍知之甚少。因此，我们开发了一种生长因子依赖性造血细胞培养模型，在该模型中，通过有条件的Cre介导的自噬本质基因Atg3的切除，自噬可以被严重破坏。处理后的细胞迅速丧失了自噬能力，并经历了细胞周期阻滞和凋亡。虽然Atg3对生长因子提取过程中线粒体氧化途径的最佳上调至关重要，但自噬的这种代谢作用似乎对细胞存活并不重要，因为提供外源性丙酮酸或脂质并不能完全缓解Atg3缺乏症。相反，自噬抑制了应激反应，否则会导致p53磷酸化，p21和促凋亡Bcl-2家族蛋白Puma上调。重要的是，表达BCR-Abl的细胞具有较低的自噬基础水平，但高度依赖于这一过程，并且在通过Atg3缺失或用化学自噬抑制剂处理破坏自噬后迅速发生凋亡。这种对自噬的依赖性在体内扩展，因为Atg3缺失也阻止了细胞移植模型中BCR-Abl介导的白血病发生。这些数据共同证明了自噬在缓解细胞应激中的关键作用，并且表达致癌激酶BCR-Abl的细胞似乎特别依赖于自噬来维持细胞生存和白血病发生。

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数字

图1
图1。造血A3C细胞群中Atg3的诱导性切除可严重破坏自噬
A类.永生化的产生和模型、培养条件和从Atg3中切除Atg3前/后A3C细胞的Rosa26-Cre-ER小鼠。B。将A3C细胞与乙醇或0.5μM 4-羟基三苯氧胺（4OHT）培养指定时间，通过免疫印迹观察Atg3的丢失。非特异性带用<表示。C类。，D。表达Bcl-2的A3C细胞用乙醇或4OHT培养4天，然后在无乙醇的情况下培养(C类)或存在(D类)使用40μM氯喹（CQ）10小时，并通过免疫印迹法评估LC3-II、GABARAP、Gate-16和p62蛋白的积累。使用LC3抗体优先识别LC3-II。E。表达A3C GFP-LC3的细胞与乙醇或4OHT培养两天，并在Amnis ImagestreamX多光谱成像流式细胞仪上进行LC3-functa分析。左侧面板显示单个细胞中LC3-bunta数量的直方图，右侧面板显示多点模式与少点模式的示例。所显示的数据代表三个或多个实验。
图2
图2。自噬的破坏导致培养中的细胞周期阻滞
答：。表达NGF的A3C对照细胞在4OHT存在或不存在的情况下培养，每天使用Coulter Z2粒子计数器评估细胞数量。B、 C、。Bcl-2表达的A3C细胞用乙醇或4OHT培养三天，第二天更换培养基并添加新药，然后用溴-2-脱氧尿苷（BrdU）培养，通过流式细胞术评估BrdU掺入和PI染色（指示DNA含量）(B类)BrdU公司和(C类)PI细胞周期分析。显示了三份样品的平均值和标准偏差。星号表示4OHT处理样品与对照处理样品的Student t检验结果p<0.05。
图3
图3。在有无生长因子的情况下，自噬中断可延缓萎缩并增加细胞死亡
答：。表达Bcl-2的细胞在存在或不存在4OHT的情况下培养四天以删除Atg3，然后在存在或没有4OHT和IL3的情况下进行培养。通过流式细胞仪前向扫描评估Bcl-2表达细胞的细胞大小。B。用乙醇或4OHT培养对照NGF或Bcl-2表达的A3C细胞两天，然后在4OHT和IL3存在或不存在的情况下培养，并用碘化丙锭排斥流式细胞术评估对照NGF和Bcl-2表示的细胞的存活率。注意不同的时间尺度。C类表达Bcl-2的A3C细胞用乙醇或4OHT培养两天以防止自噬，并从IL3中取出指定时间。通过免疫印迹分析Mcl-1、Puma、Bim和Bax。显示了一式三份样品的平均值和标准偏差。所示数据代表三个或更多实验。星号表示4OHT处理样品与对照处理样品的Student t检验结果p<0.05。
图4
图4。Atg3缺失影响细胞代谢，但这些变化似乎对生长因子戒断早期的存活并不重要
A-C.公司。表达Bcl-2的A3C细胞与IL3培养24小时或从IL3中提取(A类)糖酵解(B类)细胞内乳酸，以及(C类)测定了短链C2（乙酰基）和长链酰基肉碱C16（棕榈酸）、C18:1（油酸）和C18（硬脂酸）。D-F公司.控制NGF(D类)，表达Bcl-2(E类)，或表达谷蛋白1(F类)用乙醇或4OHT培养两天以抑制自噬，然后在有或无IL3的情况下，与5 mM油酸和棕榈酸（OP）、10 mM甲基丙酮酸（MeP）、OP+MeP或BSA的1:1混合物一起培养，作为对照，并评估细胞活力。注意不同的时间尺度.显示了三份样品的平均值和标准偏差，即质谱实验的标准误差。所显示的数据代表三个或多个实验。星号表示IL3提取样品与对照样品的Student t检验结果p<0.05B、 C类，4OHT处理的样品与对照处理的样品相比F类。
图5
图5。Atg3缺失导致细胞应激和p53活化
A、 B。表达Bcl-2的A3C细胞在4OHT存在或不存在的情况下培养两天，然后退出IL3指定时间。(A类)免疫印迹法分析内质网应激标记物Chop、BiP和Calnexin。一些细胞用2μg/mL衣霉素（Tun）处理12小时。(B类)磷酸-p53丝氨酸18、总p53、p21和DNA损伤反应蛋白γH2A。X（磷酸组蛋白H2A.X丝氨酸139）通过免疫印迹分析。C、。将FL5.12细胞从IL3中取出指定的时间和γH2A。免疫印迹分析X和p21。所示数据代表三个或更多实验。
图6
图6。BCR-Abl-transformed A3C细胞对自噬丧失敏感
答：。在存在或不存在4OHT和0.1μM伊马替尼的情况下，将表达BCR-Abl的A3C细胞培养两天，并评估存活率。B、 C类对照组NGF和BCR-Abl表达细胞在IL3和4OHT存在或不存在的情况下培养10天，第二天更换培养基并添加新的4OHT，生长细胞每两天分裂一次。(B类)通过Coulter Z2粒子计数器上的定量测量细胞随时间的累积，以及(C类)用流式细胞仪检测死亡。D。对照组NGF和BCR-Abl表达细胞用4OHT处理指定时间，并用磷酸化p53丝氨酸18、总p53、p21、Puma和γH2A处理。免疫印迹分析X。显示了三份样品的平均值和标准偏差。所示数据代表三个或更多实验。星号表示4OHT处理样品与对照处理样品的Student t检验结果p<0.05。
图7
图7。药物抑制自噬促进BCR-Abl转化的A3C细胞死亡
A、 B。对照NGF和BCR-Abl表达细胞在IL3和10μM氯喹（CQ）存在或不存在的情况下培养，更换培养基，添加新的4OHT，并在第二天分裂生长细胞。(A类)通过Coulter Z2粒子计数器上的定量测量细胞随时间的累积，以及(B类)通过流式细胞术测量死亡。C、 D。对照NGF和BCR-Abl表达细胞在有IL3或无IL3的情况下培养，用于BCR-Abl-表达细胞，并用0、5或10 mM 3-甲基腺嘌呤（3MA）培养。(A类)通过Coulter Z2粒子计数器上的定量测量细胞随时间的累积，以及(B类)通过流式细胞术测量死亡。显示了三份样品的平均值和标准偏差。所示数据代表三个或更多实验。星号表示4OHT处理样品与对照处理样品的Student t检验结果p<0.05。
图8
图8。靶向p53的shRNAi减轻Atg3切除的一些影响
答：。用控制载体或p53 shRNAi稳定转导的BCR-Abl表达细胞用4OHT和磷酸化p53丝氨酸18、总p53、p21、Puma和γH2A处理指定时间。免疫印迹分析X。提供p21、Puma和γH2A的定量。十、 归一化为相对背景和肌动蛋白。B、 C、。对有或无p53 shRNAi的BCR-Abl表达细胞用4OHT处理指定时间，更换培养基，添加新的4OHT，并在第二天分裂生长细胞。(B类)通过Coulter Z2粒子计数器上的定量测量细胞随时间的累积，以及(C类)流式细胞术检测死亡。所示数据代表三个或更多实验。星号表示4OHT处理样品与对照处理样品的Student t检验结果p<0.05。
图9
图9。自噬丧失阻止BCR-Abl的形成+同种异体移植白血病模型中的癌症
答：。免疫低下小鼠注射对照或BCR-Abl表达的A3C细胞，小鼠接受腹腔注射载体或三苯氧胺三天，并测量无病生存时间。B-C.公司。每只动物的脾脏都被切除(B类)称重，具有代表性的脾脏显示在底部面板中(C类)用苏木精和伊红进行组织学检查。平均值和标准偏差分别来自6只注射BCR-Abl表达细胞的小鼠和4只注射NGF表达细胞的老鼠。星号表示学生t检验的p<0.05。D。免疫低下小鼠注射GRP+或BCR-Abl A3C细胞，小鼠在细胞注射后立即腹腔注射载体或三苯氧胺三天，或在细胞注射两周后连续三天，如图所示。细胞注射后50天处死小鼠，并称重单个脾脏。
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