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.2010年12月14日；19(6):845-57.
doi:10.1016/j.devcel.2010.11.004。

mTORC2以cAMP和RhoA依赖的方式调节中性粒细胞趋化性

刘伦华 1, 萨塔鲁帕·达斯, 沃尔夫冈·洛塞特, 卡罗尔A父母
附属公司

mTORC2以cAMP和RhoA依赖的方式调节中性粒细胞趋化性

刘伦华等。 开发人员单元格. .

摘要

我们研究了雷帕霉素复合物2（mTORC2）靶点在中性粒细胞趋化过程中的作用，该过程是通过肌动蛋白和肌球蛋白纤维网络的极化介导的。我们发现，通过敲除Rictor（KD）实现的mTORC2活性抑制，严重抑制了趋化剂诱导的中性粒细胞极化和定向迁移，与Akt无关。Rictor KD还取消了化学引诱剂诱导cAMP生成的能力，这是一个通过激活腺苷酸环化酶9（AC9）介导的过程。AC9水平降低或升高的细胞也表现出通过RhoA介导的特异性和严重的尾部回缩缺陷。我们进一步表明，cAMP被排除在延伸伪足之外，并仅限于迁移中性粒细胞的细胞体。我们认为，在中性粒细胞趋化过程中，MyoII的mTORC2依赖性调节通过cAMP/RhoA信号轴发生，与肌动蛋白重组无关。

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数字

图1
图1。Rictor KD抑制中性粒细胞趋化性
答：。Rictor和mTOR在人血中性粒细胞和PLB-985细胞中表达。裂解细胞，并使用Rictor和mTOR特异性抗体进行Western分析。B。PLB-985细胞中的Rictor KD。细胞被裂解，并使用针对Rictor，mTOR的特异性抗体进行Western分析。结果代表了三个独立的实验。另请参见图S1A和S1B。CRictor shRNA细胞的糖下趋化性分析。中心井含有500 nM fMLP。按照实验程序进行量化。结果代表三个独立实验的平均+/-SD。*与fMLP刺激的WT组相比，表明p<0.01。另请参见图S1C。D。EZ-Taxiscan对Rictor KD细胞fMLP的趋化性。这些图像显示了单个细胞在fMLP梯度中迁移的路径，圆圈（随着时间的增加从红色到蓝色）覆盖在最后一帧上。为清晰起见，仅显示在10个连续帧中移动的单元格。然而，包括所有细胞进行量化（见图S3E）。数据代表了六个独立实验。另请参阅电影S1。E.公司。Rictor KD细胞对fMLP点源的趋化作用。每10秒拍摄一次分化细胞迁移到含有1μM fMLP的微移液管的图像。星形表示微量吸管尖端的位置。亮场和荧光图像的叠加是三个独立实验的代表。另请参阅电影S2。F、。fMLP刺激后，Rictor shRNA细胞显示出均匀的F-actin积累。用均匀浓度的fMLP（1μM）刺激分化细胞10分钟并固定。罗丹明-球蛋白染色检测F-actin。结果代表了三个独立的实验。另请参见图1D。G.公司。fMLP刺激后，Rictor shRNA细胞显示正常的F-actin聚合。用均匀浓度的fMLP（1μM）刺激分化细胞，并将其固定在指定的时间点。罗丹明-球蛋白染色法检测F-肌动蛋白含量。结果表示三个独立实验的平均+/-SD。另请参见图1E。
图2
图2。Rictor以Akt非依赖性和PKC依赖性方式调节趋化性和趋化剂诱导的cAMP积累
答：。EZ-Taxiscan对雷帕霉素处理的人血中性粒细胞fMLP的趋化性。使用或不使用100 nM雷帕霉素处理中性粒细胞30分钟。数据是三个独立实验的代表。详见图例图1D。没有显示24小时治疗的路径，因为没有检测到明显的运动。另请参见图S2A、S2B、S2D和电影S3。B。Akt或cPKC的糖下趋化性试验抑制了人血中性粒细胞。用10μM Akt抑制剂VIII或10μM cPKC抑制剂GO6976处理中性粒细胞30分钟。中心孔含有500 nM fMLP。按照实验程序进行量化。结果代表三个独立实验的平均+/-SD。#表示与车辆fMLP组相比p<0.05。C、。EZ-Taxiscan对Akt抑制的人血中性粒细胞fMLP的趋化性。使用或不使用10μM Akt抑制剂VIII处理中性粒细胞30分钟。数据是五个独立实验的代表性数据。详见图例图1D。另请参见图S2D和电影S3。D。EZ-Taxiscan对cPKC的fMLP的趋化性抑制了人血中性粒细胞。使用或不使用10μM GO6976处理中性粒细胞30分钟。插入显示细胞的更高放大率图像。数据是五个独立实验的代表。详见图例图1D。另请参见图S2D和电影S3。E.公司。Rictor KD抑制fMLP诱导的cAMP生成。用1μM fMLP刺激分化细胞30秒，并在添加化学引诱剂前后测量细胞内cAMP水平。插图显示了细胞内cAMP水平的时间进程测量。SEM值来自六个独立实验。*与fMLP刺激的NS shRNA组相比，表明p<0.01。另请参见图S2E。F、。cPKC而非Akt调节fMLP诱导的cAMP生成。用10μM Akt抑制剂VIII或10μM cPKC抑制剂GO6976处理人血中性粒细胞30分钟。在添加化学引诱剂前后测量细胞内cAMP水平。结果代表三个独立实验的平均+/-SD。*与fMLP刺激的载体组相比，表明p<0.01。另请参见图S2F。
图3
图3。趋化剂诱导的cAMP生成由AC9介导，是中性粒细胞趋化所必需的
答：。PLB-985细胞中AC9表达的KD。提取细胞总RNA，实时RT-PCR检测AC9 mRNA水平。结果表示三个独立实验的平均+/-SD。另请参见图S3A。B。AC9表达的KD抑制化学引诱剂诱导的cAMP生成。在1μM fMLP刺激分化细胞前和30秒后测量细胞内cAMP水平。插图显示了细胞内cAMP水平的时间进程测量。SEM值来自六个独立实验。#与缓冲液NS shRNA组相比，p＜0.05；*与fMLP刺激的NS shRNA组相比，表明p<0.01。另请参见图S3B和S3C。C、。AC9 shRNA（1）细胞的糖下趋化性测定。中心井含有500 nM fMLP。按照实验程序进行量化。结果代表四个独立实验的平均+/-SD。*与fMLP刺激的NS shRNA组相比，表明p<0.01。另请参见图S3D。D。EZ-Taxiscan对AC9 KD细胞fMLP的趋化性。数据代表了六个独立实验。详见图例图1D。另请参见图S3E和影片S1。E.公司。AC9 shRNA（1）细胞对fMLP点源的趋化作用。分化细胞迁移到含有1μM fMLP的微量移液管的图像。星形表示微量吸管尖端的位置。亮场和荧光图像的叠加是三个独立实验的代表。另请参阅电影S4。
图4
图4。外源性AC9表达抑制趋化因子诱导的cAMP生成和趋化性
答：。荧光图像描绘金星、AC3-eGFP或AC9-Venus在分化和迁移细胞中的亚细胞分布。B。AC9的过度表达导致基础cAMP水平升高，并抑制化学引诱剂诱导的cAMP生成。用1μM fMLP刺激分化细胞30秒，并在添加化学引诱剂前后测量细胞内cAMP水平。SEM值来自六个独立实验。#表示与缓冲金星组相比p<0.05；*与fMLP刺激的金星组相比，表明p<0.01。C、。AC9的KD抑制AC3-eGFP过表达细胞中化学引诱剂诱导的cAMP生成。用1μM fMLP刺激分化细胞，并在指定的时间点测量细胞内cAMP水平。三个独立实验的平均+/-SD。另请参见图S4C。D。AC9-Venus和AC3-eGFP细胞的糖下趋化性分析。中心井含有500 nM fMLP。按照实验程序进行量化。结果表示三个独立实验的平均+/-SD。*与fMLP刺激的金星组相比，表明p<0.01。另请参见图S4D。E.公司。AC9 Venus细胞在趋化过程中表现出长尾。每10秒拍摄一次分化细胞迁移到含有1μM fMLP的微移液管的图像。星形表示微量吸管尖端的位置。亮场图像是三个独立实验的代表。另请参阅电影S5。F、。AC9-金星细胞有较强的尾部附着。用1μM fMLP刺激分化细胞，每10秒记录一次IRM图像。黑色箭头表示相位图像中尾部的位置。展示了具有代表性的图像。另请参阅电影S6。
图5
图5。在随机迁移和趋化的中性粒细胞中，cAMP被排除在扩展假足之外
答：。区分的NS shRNA和AC9 shRNA的基本FRET效率图像以假彩色表示。另请参见图S5A。在AC9 KD细胞中观察到低cAMP水平时，探针保持闭合状态，FRET反应最大。在cAMP存在下，发生构象变化，FRET响应丢失。B。分化NS shRNA和AC9 shRNA细胞的平均基础FRET效率，n=8.*与NS shRNA细胞相比，p<0.01。C、。在表达WT FRET传感器的NS shRNA和AC9 shRNA细胞以及表达突变FRET传感器（R96E）的NS shRNA细胞中用1μM fMLP均匀刺激后FRET效率的时间进程。左侧面板显示FRET效率测量区域。右侧面板显示了表达WT FRET传感器的NS shRNA和AC9 shRNA细胞在不同时间点的FRET效率图像。另请参见图S5B和电影S7。D。将分化的NS shRNA细胞暴露于含有1μM fMLP的微量吸管中。微量吸管的位置由星号表示。伪彩色图像取自一个具有代表性的实验，代表FRET效率。另请参阅电影S7。E.公司。以15秒间隔采集的三个连续时间点的FRET强度随细胞长轴位置变化的曲线图（用红色、蓝色和黑色线条表示）。每个点都是平滑区域的平均值，该平滑区域横跨单元格宽度5.6μm，沿单元格长轴2.1μm（虚线方框表示滑动平滑区域的大小）。上箭头指示细胞迁移的方向。绿线表示细胞内CFP荧光的强度。
图6
图6。AC9调节RhoA活性和磷酸化肌球蛋白II水平
答：。AC9-Venus和AC9-KD细胞表现出较高的P-MLC染色。用1μM fMLP均匀刺激分化细胞15分钟并固定。给出了具有代表性的双图像。B。AC9-Venus、AC9-shRNA和Rictor shRNA细胞显示较高的P-MLC水平。将分化的细胞置于纤连蛋白包被的平板上10分钟，并用1μM fMLP均匀刺激。在特定时间点，使用抗P-MLC抗体对样本进行西方分析。三个实验的定量表示为fMLP刺激后与未刺激细胞相比的P-MLC量（平均值±SD）。通过将其值除以同一时间点的总MLC值，对每个点的P-MLC量进行标准化。另请参见图S6A。*表示p<0.01和#与Venus或NS shRNA细胞相比，表明p<0.05。C、。AC9-Venus、AC9-shRNA和Rictor shRNA细胞显示RhoA-GTP激活缺陷。分化后的细胞按B组处理。三个实验的定量表示为fMLP刺激后RhoA-GTP的量相对于WT未刺激细胞的量（平均值±SD）。通过将其值除以同一时间点的总RhoA值，对每个点的RhoA-GTP量进行标准化。另请参见图S6C.*表明p<0.01#表明与Venus或NS shRNA细胞相比p＜0.05。
图7
图7。化学引诱剂介导的细胞内cAMP水平增加如何调节中性粒细胞回缩的示意图
详见正文。
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中的注释

  • “TORCing”中性粒细胞趋化性。
    Charest PG，Firtel RA公司。 Charest PG等人。 开发单元。2010年12月14日；19(6):795-6. doi:10.1016/j.devcel.2010.11.017。 开发单元。2010 PMID：21145496 免费PMC文章。
  • 细胞迁移：MTORC2位于后方。
    大卫·R。 大卫·R。 Nat Rev Mol细胞生物学。2011年2月；12(2):74. doi:10.1038/nrm3046。Epub 2011年1月12日。 Nat Rev Mol细胞生物学。2011 PMID：21224887 没有可用的摘要。

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