Synaptic targeting of AMPA receptors is regulated by a CaMKII site in the first intracellular loop of GluA1

doi:10.1073/pnas.1016289107

.2010年12月21日；107(51):22266-71.

doi:10.1073/pnas.1016289107。 Epub 2010年12月6日。

AMPA受体的突触靶向性受GluA1第一胞内环中CaMKII位点的调控

魏璐¹, Kaname Isozaki先生, 凯瑟琳·罗什, 罗杰·尼科尔

附属公司

PMID： 21135237
PMCID公司： PMC3009812型
内政部： 10.1073/pnas.1016289107

AMPA受体的突触靶向性受GluA1第一胞内环中CaMKII位点的调控

魏璐等。美国国家科学院程序. 2010.

.2010年12月21日；107(51):22266-71.

doi:10.1073/pnas.1016289107。 Epub 2010年12月6日。

作者

魏璐¹, Kaname Isozaki先生, 凯瑟琳·罗什, 罗杰·A·尼科尔

附属

¹美国加州大学旧金山分校细胞和分子药理学系，邮编：94143。

PMID： 21135237
PMCID公司： PMC3009812型
内政部： 10.1073/pnas.1016289107

摘要

突触上AMPA受体（AMPAR）的积累对兴奋性突触传递至关重要。然而，AMPAR突触靶向性的机制尚不清楚。我们现在已经在AMPAR-全背景下使用分子替换方法来研究调节海马AMPAR贩运所必需的靶向机制。虽然有大量文献研究GluA1 C-tail在AMPAR贩运中的作用，但C-tail的过度表达对基础传播没有影响。相反，我们发现GluA1的第一个细胞内环路域（Loop1）是AMPAR中以前被忽视的区域，对突触的受体靶向至关重要，但对受体向质膜的传递并不重要。我们还鉴定了GluA1环1中的CaMKII磷酸化位点（S567），该位点在体内外均被磷酸化。此外，我们证明S567是调节环1介导的AMPAR贩运的关键残基。因此，我们的研究揭示了将AMPAR靶向突触以介导突触传递的独特机制。

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作者声明没有利益冲突。

数字

**图1。**
GluA1 Loop1的表达损害突触传递。(A类)AMPAR亚单位的拓扑结构，用箭头指示Loop1和C-tail。(B类)GluA1、GluA2和GluK2 Loop1结构域的序列比对。(*C–G类*)散点图显示了GluA1 C-tail表达的单对EPSC振幅（○）和平均值±SEM振幅（●）(*C、，*AMPA公司：n个= 11,*P（P）*= 0.71; 国家药品监督管理局：n个= 11,*P（P）*=0.90），GluA1回路1(*D、，*AMPA公司：n个= 28, **P（P）*< 0.001; 国家药品监督管理局：n个= 25,*P（P）*=0.77），GluA2回路1(*E、，*放大器：n个= 36, **P（P）*< 0.05; 纳米da：n个= 36,*P（P）*=0.20），GluK2回路1(*F、，*AMPA公司：n个= 16,*P（P）*= 0.62; 国家药品监督管理局：n个= 15,*P（P）*=0.21）在WT锥体细胞中，GluA1 Loop1在GluA1 KO细胞中(*G、，*AMPA公司：n个= 12,*P（P）*= 0.89; 国家药品监督管理局：n个= 12,*P（P）*= 0.98). （比例尺：0.02 s、20、50、20、25和20 pA inC、 D、E、F、，和*G、，*）(*H（H）*)摘要条形图显示了对照细胞AMPAR和NMDAR EPSC的振幅百分比（平均值±SEM）*C–G类*.

**图2。**
GluA1 Loop1是将GluA1同源体贩运到突触所必需的。(A类)GluA1和GluA1/K2嵌合体的示意图，其中GluA1 Loop1被GluK2的Loop1替换（GluK2-Loop1为红色）。(B类)在薄片培养中采集锥体神经元的外斑电流*格栅1-3^{飞行/飞行}*（抄送：n个= 12; Cre+GluA1：n个= 10; Cre+GluA1/K2：n个= 9;*P（P）*>所有比较均为0.05）。（比例尺：1s，200 pA）外斑电流I/V曲线的RI显示，表达的受体缺乏GluA2（Cnt：n个= 10; Cre+GluA1：n个= 8; Cre+GluA1/K2：n个= 5; **P（P）*与Cnt相比<0.001；*P（P）*＝0.47，用于比较Cre+GluA1和Cre+GluA1/K2）。(*C–F类*)散点图显示了单对EPSC的振幅（○）和平均值±SEM（●）C类和E类显示AMPAR和NMDAR EPSC的振幅(*C、，*AMPA；n个= 13;*P（P）*= 0.07; NMDA；n个= 13;*P（P）*= 0.26; 和*E、，*AMPA；n个= 13, **P（P）*< 0.001; NMDA；n个= 12;*P（P）*= 0.76). (D类和F类)条形图显示平均RI(*D、，*抄送：n个= 24; Cre+GluA1：n个= 8; GluA2 KO：n个= 5; **P（P）*Cnt和Cre+GluA1之间<0.001；*P（P）*=0.20（Cre+GluA1和GluA2 KO之间）和(*F、，*抄送：n个= 24; Cre+GluA1/K2：n个= 8; GluA2 KO：n个= 5; **P（P）*Cnt和Cre+GluA1/K2之间<0.001；*P（P）*=0.58（Cre+GluA1/K2和GluA2 KO之间）。左侧是代表性的叠加记录道（黑色、Cnt；绿色、Cre+GluA1或GluA1/K2）。（比例尺：0.02 s，50 pA inC、，10 pA英寸*D、，*50 pA英寸*E、，*和20 pA英寸*F、。*)误差线代表平均值±SEM。

**图3。**
GluA1-Loop1是GluA1A2异构体向突触转运所必需的。(A类)在薄片培养中采集锥体神经元的外斑电流*网格1-3^{飞行/飞行}*用mCherryCre-IRES-GluA1和GluA2或mCherryCre-IRES-GluA1/K2和GluA2转染（Cnt：n个= 12; Cre+GluA1+A2：n个= 11; Cre+GluA1/K2+A2：n个= 9;*P（P）*>所有比较均为0.2。（比例尺：1秒，200 pA）。从所示细胞中取出的外贴片的I/V曲线RI显示，表达的受体含有GluA2（Cnt:n个= 10; Cre+GluA1+A2：n个= 8; Cre+GluA1/K2+A2：n个= 6;*P（P）*>所有比较均为0.20）。(*B–E类*)散点图显示了单对EPSC的振幅（○）和平均值±SEM（●）B类和D类表明～98%的AMPAR EPSCs通过GluA1和GluA2的表达而被挽救(*B、，*AMPA公司：n个= 14;*P（P）*= 0.93; 国家药品监督管理局：n个= 12;*P（P）*=0.50），和～60%的AMPAR EPSCs通过GluA1/K2和GluA2的表达被挽救(*D、，*AMPA公司：n个= 12, **P（P）*< 0.005; 国家药品监督管理局：n个= 11;*P（P）*= 0.95). (C类和E类)条形图显示平均RI（C，Cnt：n个= 24; Cre+GluA1+A2：n个= 8;*P（P）*= 0.70;*E、，*抄送：n个= 24; Cre+GluA1/K2+A2：n个= 5;*P（P）*= 0.97). 左侧是代表性的叠加记录道（黑色、Cnt；绿色、Cre+GluA1或GluA1/K2+A2）。（比例尺：0.02 s，40 pA inB、，20 pA英寸C类，50 pA英寸*D、，*和50 pA英寸*E.公司。*)误差线代表平均值±SEM。

**图4。**
GluA1环1在S567上被CaMKII磷酸化。(A类)GluA1 Loop1被CaMKII磷酸化。GST融合蛋白与CaMKII和[γ-³²P] ATP和放射自显影分析。GluA1和GluA2的环1结构域的序列比对表明，在7个Ser/Thr残基中，GluA1的T577是一个一致的CaMKII磷酸化位点。(B类)用纯化的PKA催化亚基或PKC与[γ-³²P] ATP，放射自显影分析。(C类)GluA1 Loop1结构域中CaMKII磷酸化位点S567的鉴定。GST-GluA1环1中7个Ser/Thr残基中的每一个都被突变为Ala，并在体外使用[γ]被CaMKII磷酸化-³²P] ATP和放射自显影分析。通过蛋白质染色显示GST融合蛋白总量*A–C。*

**图5。**
GluA1 S567在体内外的磷酸化。(A类和B类)体外使用CaMKII在S567上磷酸化GST-GluA1环1，但不磷酸化PKA或PKC。如图所示，GST和GST-GluA1环1（WT、S567A和S567D）在体外磷酸化，并用pS567-Ab进行免疫印迹分析(C类)pS567-Ab识别GluA1，但不识别GluA2磷酸化。FLAG标记的AMPAR亚基在HEK293T细胞中表达，用FLAG M2亲和凝胶免疫沉淀，体外用CaMKII磷酸化，用pS567-Ab免疫印迹分析(D类)GluA1在体内S567被磷酸化。将成年大鼠海马溶解，并从裂解液中免疫沉淀GluA1。免疫沉淀物通过SDS/PAGE溶解，并用指示的抗体进行免疫印迹。

**图6。**
GluA1 S567的磷酸化调节AMPAR向突触的转运。(A类)在薄片培养中采集锥体神经元的外斑电流*格栅1-3^{飞行/飞行}*（抄送：n个= 12; Cre+S567A：n个= 10; Cre+S567D：n个= 10;*P（P）*>所有比较均为0.05）。（比例尺：1s，200 pA）(B类)散点图显示了单对EPSC的振幅（○）和平均值±SEM（●）。右侧的条形图显示了AMPAR和NMDAR EPSC的幅度(*上部，*AMPA公司：n个= 14;*P（P）*= 0.18; 国家药品监督管理局：n个= 14;*P（P）*=0.46）和(*降低，*放大器：n个= 12, **P（P）*< 0.001; 国家药品监督管理局：n个= 12;*P（P）*= 0.47). 比例尺：0.02 s，50 pA in上部，20 pA英寸*降低。*(C类)FLAG-GluA1（WT、S567A或S567D）在培养的海马神经元中表达，并在DIV 17时进行分析。表面受体显示为白色，细胞内受体显示为红色。*P（P）*>所有比较均为0.05(n个=31–39个细胞；n个=4个独立实验）。（比例尺，20μm）(D类)在DIV 17分析海马神经元内源性PSD-95和FLAG-GluA1（WT、S567A或S567D）的克隆化**P（P）*< 0.001 (n个=30-40个单元；n个=3个独立实验）。（比例尺，5μm）误差线代表平均值±SEM。

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