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.2011年1月；10(1):63-71.
doi:10.1128/EC.00241-10。 Epub 2010年11月19日。

Hph1和Hph2是Sec63/Sec62翻译后易位复合体的新成分，有助于空泡质子ATP酶的生物发生

弗朗西斯科·皮涅 1, Allyson F O'Donnell公司, Silver Pagant公司, 海蓝飘, 约翰·普·米勒, 斯坦利·菲尔兹, 伊丽莎白·A·米勒, 玛莎·塞尔特
附属公司

Hph1和Hph2是Sec63/Sec62翻译后易位复合体的新成分，有助于空泡质子ATP酶的生物发生

弗朗西斯科·皮涅等。 真核细胞. 2011年1月.

摘要

Hph1和Hph2是酿酒酵母在环境胁迫条件下生存所需的同源完整内质网（ER）膜蛋白。为了研究Hph1和Hph2的分子功能，我们进行了一个基于分裂-泛素膜的酵母双杂交筛选，并鉴定了它们与Sec63/Sec62复合物的一个亚单位Sec71的相互作用，该亚单位介导蛋白质翻译后易位到内质网，因为它们与其他Sec63/Sec62复合亚单位，即Sec72、Sec62和Sec63相互作用。hph1Δhph2Δ细胞液泡酸化减弱；空泡质子ATP酶（V-ATP酶）亚单位Vph1的不稳定性增加；和生长缺陷类似于缺乏V-ATP酶活性的突变体。sec71Δ细胞表现出相似的表型，表明Hph1/Hph2和Sec63/Sec62复合物在V-ATPase生物发生过程中发挥作用。Hph1/Hph2和Sec63/Sec62复合物可能在这一过程中共同作用，因为在Hph1ΔHph2Δ和Hph1△Hph2△sec71Δ细胞中，液泡酸化和Vph1稳定性受到相同程度的损害。相反，Pkr1是一种促进Vph1与V-ATPase亚单位的转位后组装的ER蛋白，其缺失进一步加剧了hph1Δhph2Δ表型，表明hph1和hph2的功能独立于Pkr1-mediated V-ATPases组装。我们认为，Hph1和Hph2有助于Sec63/Sec62介导的特定蛋白质的易位，包括促进V-ATP酶高效生物生成的因子，以支持酵母细胞在环境胁迫期间的存活。

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数字

图1。
图1。
Hph1与钙调神经磷酸酶本身和Hph2相互作用。Hph1和Hph2还与翻译后易位机制的组成部分相互作用，即Sec63/Sec62复合物。（A） 钙调磷酸酶与GST-Hph1铜化，但与GST-Hph1铜不铜化ΔPVIAVN或GST-Hph2。从表达GST-Hph1、GST-Hph2或GST-Hph 1的野生型细胞（BY4742）提取物中纯化GST融合蛋白ΔPVIAVN用抗GST和抗Cna2抗血清进行SDS-PAGE和免疫印迹分析。（B） GST-Hph1或GST从马力1Δ马力2Δ细胞（VHY70）共表达GFP、GFP-Hph1或GFP-Hph 2，并用SDS-PAGE和抗GST抗GFP抗血清进行免疫印迹分析。（C） 从含有Sec71、Sec72、Sec62、Sec63或Sec61基因的基因组整合TAP标记等位基因的细胞提取物中纯化GST、GST-Hph1或GST-Hph 2（21）；SDS-PAGE分析；用抗GST和抗TAP抗体进行免疫印迹。
图2。
图2。
高功率1Δ马力2Δ细胞对高浓度重金属（ZnCl）条件下的生长敏感2，氯化镉2，氯化钴2和CsCl2)，氯化钙2、氧化应激（H2O（运行）2)以及一种不可发酵的碳源（乙醇）。马力1Δ细胞对ZnCl上的生长敏感2.野生型（BY4741），马力1Δ（编号1621），马力2Δ（编号380），以及马力1Δ马力2Δ（VHY60）菌株在YPD中生长到固定相。将培养物稀释至2.5×106将细胞/ml和7倍系列稀释液涂布在含有所示添加剂的YPD板上。将平板在室温下培养2天（YPD，pH 7.6，CaCl2和YP-乙醇），4天（氯化锌2，氯化镉2，氯化钴2、CsCl2、和H2O（运行）2)和5天（NaCl和LiCl）。
图3。
图3。
马力1Δ马力2Δ细胞的生长缺陷谱与vma21型Δ细胞，液泡酸化部分缺陷，Vph1周转增加。（A） 野生型（BY4741），马力1Δ高功率2Δ（VHY60），以及vma21型Δ（数量4735）细胞生长到静止期。培养物稀释至2.5×106在含有YPD（pH 5.5）的平板上发现每毫升细胞数和7倍系列稀释液，并指示添加量。（B） 酵母菌株（与面板A相同）用奎那克林染色，染色后立即成像。（C） 喹吖啶染色细胞的荧光按文中所述进行量化，并归一化为野生型细胞的平均荧光。用SDM表示三个重复样品的平均荧光强度，并将其归一化为WT。（D） 通过脉冲相分析测定了指示菌株中Vph1的半衰期。
图4。
图4。
秒71Δ细胞表现出减少的液泡酸化和Vph1稳定性，这与马力1Δ马力2Δ. （A） 野生型（BY4741），马力1Δ马力2Δ（VHY60），秒71Δ（编号3311），以及马力1Δ马力2Δ秒71Δ细胞用奎那克林染色，空泡荧光定量。三个重复样品的平均荧光强度（归一化为WT）用SDM表示。（B） Vph1的半衰期在野生型（BY4741）中测定，马力1Δ马力2Δ（VHY60），秒71Δ（编号3311），以及高功率1Δ马力2Δ第71页脉冲相位分析Δ电池。
图5。
图5。
pkr1号机组Δ加剧生长缺陷和液泡酸化缺陷马力1Δ马力2Δ单元。（A） 野生型荧光（BY4741），马力1Δ马力2Δ（VHY60），pkr1号机组Δ（编号6564），以及马力1Δ高功率2Δpkr1号机组用奎那克林孵育后测定Δ细胞，并将其归一化为野生型细胞的平均荧光。误差条代表传感和诊断模块SDM。（B） 野生型（BY4741），马力1Δ马力2Δ（VHY60），pkr1号机组Δ（编号6564），以及马力1Δ马力2Δpkr1号机组按照图3A所示对Δ细胞进行电镀，并在30°C下生长2天。
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