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.2010年11月23日；103(11):1671-9.
doi:10.1038/sj.bj.6605968。 Epub 2010年11月2日。

CXCL12-CXCR4信号轴使吉西他滨对胰腺癌细胞产生耐药性：一种新的治疗靶点

S辛格 1, S K斯利瓦斯塔瓦, 巴德瓦吉, L B欧文, A P辛格
附属公司

CXCL12-CXCR4信号轴使吉西他滨对胰腺癌细胞产生耐药性：一种新的治疗靶点

S辛格等。 英国癌症杂志. .

摘要

背景：胰腺癌细胞对药物治疗高度耐药；然而，其根本原因在很大程度上仍不清楚。我们假设CXCL12-CXCR4信号的激活通过增强存活率而赋予胰腺癌细胞耐药性。CXCR4在癌前/恶性胰腺病变和癌干细胞中过度表达，并与其发病机制有关。

方法：通过MTT、DNA阶梯、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性、免疫印迹和启动子报告分析，检测CXCL12激活CXCR4对抑制吉西他滨诱导的细胞毒性和刺激胰腺癌细胞生存信号的作用。随后，我们检测了CXCR4拮抗剂AMD3100在消除激活的CXCL12-CXCR4信号传导的拯救作用方面的作用。

结果：与单用药物治疗的细胞相比，用吉西他滨治疗的胰腺癌细胞在CXCL12存在下的细胞毒性降低。CXCL12诱导FAK、ERK和Akt信号通路的激活，增强β-catenin和NF-κB的转录活性，以及生存蛋白的表达。AMD3100阻止了CXCL12诱导的胰腺癌细胞生长和耐药性。

结论：我们的发现首次证明了CXCL12-CXCR4信号转轴在赋予胰腺癌细胞耐药性中的作用，并表明它可以作为胰腺癌治疗的新靶点，单独或与细胞毒药物联合使用。

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数字

图1
图1
胰腺癌细胞中CXCR4和CXCL12的表达和生长反应。(一个)从12个胰腺癌细胞株中分离出总蛋白，并通过电泳在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行解析。随后，用抗CXCR4兔多克隆抗体对凝胶进行免疫印迹，并用抗-β-肌动蛋白（内部对照）小鼠单克隆抗体。CXCR4在所有检测的胰腺癌细胞系中均表达（不同水平）。(B类)使用商业试剂盒，在无血清条件下培养72小时的胰腺癌细胞培养基上进行酶联免疫吸附试验（ELISA）。低水平CXCL12表达（13–230 pg/ml/106细胞）。(C类)胰腺癌细胞（MiaPaCa和Panc1）对CXCL12治疗（100 ng ml）的生长反应−1)指示CXCL12–CXCR4信令轴的功能。CXCL12刺激（在缺乏血清和补充血清的培养基中）导致显著诱导(*P（P）胰腺癌细胞的生长。与含血清培养物相比，无血清条件下的反应更为明显，这可能是由于其他血清因子的补偿性促生长作用。
图2
图2
从吉西他滨对CXCL12治疗的毒性中拯救胰腺癌细胞。两种胰腺癌细胞系Panc1(一个)和MiaPaCa(B类)，用不同剂量的吉西他滨治疗（0–10μM（M）)在补充血清的条件下，有无CXCL12（100 ng ml−1). 采用MTT法检测治疗后72 h肿瘤细胞的活性。显著保护胰腺癌细胞免受吉西他滨毒性的影响（5岁和10岁时μM（M）)通过CXCL12观察。数据显示为未经处理或仅经CXCL12处理的细胞的相对存活率，以控制CXCL12的生长促进作用(*P（P）<0.01).
图3
图3
CXCL12治疗对吉西他滨诱导的细胞死亡的抗凋亡作用。(一个)DNA片段分析。将细胞接种在6厘米的培养皿中，并用5和10处理μM（M）吉西他滨在没有或存在CXCL12的情况下（100 ng ml−1)48小时后，分离并解析基因组DNA（2μg每车道）。车道1：未经治疗，车道2和3：吉西他滨治疗（5和10μM（M）)分别，以及第4和第5车道：吉西他滨治疗（5和10μM（M））。与仅用吉西他滨治疗的细胞相比，CXCL12治疗的胰腺癌细胞的DNA阶梯减少。(B类)现场细胞凋亡的测定。将Panc1和MiaPaCa细胞培养在培养箱载玻片上，并用吉西他滨（5μM（M）)在没有和存在CXCL12（100 ng ml-1). 用CaspACE FITC-VAD-FMK溶液在37°C的PBS中染色2 h，检测细胞凋亡。固定后，在共焦显微镜下通过荧光检测显示结合标记。代表性图片（FITC和DAPI叠加）来自未经治疗、仅吉西他滨和吉西他宾+CXCL12治疗的Panc1和MiaPaCa细胞的随机区域之一。FITC-标记标记阳性的凋亡细胞在10个随机域中计数，并以条形图表示（平均值±标准差）。*与仅经吉西他滨处理的细胞相比，差异显著。CXCL12联合处理的细胞显示吉西他滨分别降低了Panc1和MiaPaCa细胞的53%和55%的凋亡。
图4
图4
CXCL12诱导FAK、Akt和ERK通路的激活。用CXCL12（100 ng ml）处理亚流入的Panc1和MiaPaCa细胞培养物−1)持续5、15和30分钟。蛋白质通过电泳在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上提取和分解。FAK、Akt和ERK通路的激活通过使用所示的总抗体和磷形态特异性抗体的免疫印迹法进行评估。β-Actin起到了内部控制的作用。CXCL12治疗诱导了Panc 1和MiaPaCa细胞系中所有三种效应蛋白的磷酸化，同时伴随着促凋亡BAD蛋白的失活磷酸化。
图5
图5
诱导β-catenin/TCF和NF-κ胰腺癌细胞中CXCL12的B转录活性和生存蛋白表达。(一个)用TOPflash或FOPflash或NF转染胰腺癌细胞-κB荧光素酶报告子构建与Renilla荧光素酶构建一起控制转染效率。细胞转染后24小时用CXCL12处理，并在被动裂解缓冲液中分离蛋白。使用双荧光素酶测定系统评估荧光素酶活性，数据显示为正常化后荧光素酶活性的倍数变化。条形代表三倍±标准差的平均值。；*统计显著差异(P（P）<0.01). (B类)通过免疫印迹法检测CXCL12处理细胞在不同时间段内Bcl-2、Bcl-xL、Notch 1和survivin表达的变化。在CXCL12治疗的胰腺癌细胞中检测到所有四种生存蛋白的表达增加。
图6
图6
CXCR4靶向和阻断PI3K或Erk通路对CXCL12在胰腺癌细胞中对吉西他滨诱导毒性的细胞保护作用的影响。(一个)用AMD3100（5μ克毫升−1)或LY294002（20μM（M）)或PD98059（25μM（M）)在用CXCL12诱导前1小时。CXCL12治疗15分钟后分离总蛋白，并通过免疫印迹法检测Akt和ERK的总蛋白和磷酸化形式的活化。AMD3100抑制了Akt和ERK通路的激活，而LY294002和PD98059分别特异性抑制了Att和ERK途径。(B类)用AMD3100或LY294002或PD98059或PBS预处理细胞1h。随后，用CXCL12或吉西他滨单独或联合处理细胞。MTT法检测细胞活力。条形代表三倍±标准差的平均值。；*统计显著差异(P（P）<0.01）关于吉西他滨+CXCL12处理的细胞。条形图1：未治疗，2:CXCL12治疗，3:AMD3100治疗，4:AMD3100+CXCL12处理，5:吉西他滨治疗，6:吉西他宾+CXCL12+治疗，7:AMD3100-预治疗+吉西他宾+CXCL12-治疗，8:LY294002预治疗+吉西他宾+CXCL12-治疗，9:PD98059-预处理+吉西他滨+CXCL12.治疗。
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