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.2010年11月9日；107(45):19338-43.
doi:10.1073/pnas.1010554107。 Epub 2010年10月25日。

Rubicon作为Rab7效应器控制内体成熟

孙启明 1, 威布克·韦斯特法尔, Kwon Ngok Wong（王观恩）, 伊雷娜·谭, 清忠
附属公司

Rubicon作为Rab7效应物控制内体成熟

孙启明等。 美国国家科学院程序. .

摘要

小GTPase Rab7在早期内体中的激活和补充是内体成熟早期到晚期的关键步骤，这一过程需要III类磷脂酰肌醇3-激酶（PI3KC3）和GTPase调节器。然而，Rab7激活和内体成熟的分子机制仍不明确。在这里，我们报告了PI3KC3复合物的一种成分Rubicon通过与Rab7和UVRAG的差异相互作用阻止内体成熟。UVRAG-激活PI3KC 3和C-VPS/HOPS，这是一种鸟嘌呤核苷酸交换因子，催化Rab7上GTP的GDP交换。我们证明，潞碧垦能够从C-VPS/HOPS中隔离UVRAG。活性GTP结合的Rab7竞争Rubicon结合，并释放UVRAG与C-VPS/HOPS结合，从而促进Rab7与GTP的进一步加载。这种前馈回路确保了GTP-结合的Rab7的快速扩增，从而刺激内体成熟。因此，Rubicon作为一种以前未知的Rab7效应物，以确保内吞途径的正确进展。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
潞碧垦通过其C末端与Rab7相互作用。(一个)潞碧垦与Rab7互动，但与Rab5没有互动。Rubicon-Flag载体与Rab5-Myc（1–3道）或Rab7-Myc载体（4–6道）共转染。将整个293T细胞裂解物（第1和第4道）用抗Flag抗体（第3和第6道）或对照IgG（第2和第5道）免疫沉淀，然后用Rubicon的抗Flag抗体和Rabs的抗Myc抗体免疫印迹。(B类)潞碧垦在不同的复合物中与UVRAG和Rab7相互作用。Myc标记的Vps34、Beclin 1、Vps16、Rab7和Rubicon在HEK293T细胞中表达，并用抗Myc抗体进行免疫沉淀（IP）。通过免疫印迹（IB）检测结合组分（B）和输入组分中的蛋白。(C类)Rubicon的CT域是Rab7绑定所必需的。将表达HA标记Rab7的载体与EGFP-Rubicon-Flag（WT）载体或表达不同突变体的载体共转染，然后用抗HA抗体（Rab7）进行免疫沉淀，并用所示抗体进行免疫印迹。
图2。
图2。
潞碧垦优先与GTP结合的Rab7结合。(一个)Rubicon在体内与GTP结合的Rab7结合。将Rubicon-Flag载体与表达Rab7-WT、GTP-bounded Rab7 Q67L突变或GDP-bound Rab7 T22N突变的Rab7-Myc载体共转染HEK293T细胞，然后用抗Myc抗体（Rab7）进行免疫沉淀并用所示抗体进行免疫印迹。(B类)Rab7与Rubicon和p150发生差异性相互作用。纯化的重组HA标记的Rab7（0.1μM）与重组标记的p150、Vps34、Beclin 1、UVRAG、Barkor/Atg14（L）或Rubicon（0.1μM）在使用HA亲和珠的体外下拉试验中孵育。结合蛋白和输入蛋白用抗Flag或HA抗体检测。(C类)潞碧垦直接结合GTP结合的Rab7。用HA亲和珠与重组HA标记的Rab7 WT、T22N或Q67L突变蛋白（0.1μM）预结合的HA亲和小球培养重组全长标记的p150、Vps34或Rubicon（0.1μM）。结合蛋白用7.5%SDS/PAGE进行解析，并用抗Flag抗体进行Western blot分析。
图3。
图3。
GTP结合的Rab7与UVRAG竞争Rubicon结合。(一个)UVRAG的过度表达损害了Rab7-Rubicon相互作用。不同浓度的UVRAG在HEK293T细胞中过度表达(顶部)，并用抗Rab7抗体对所得细胞裂解物进行免疫沉淀(中部)或抗潞碧垦抗体(底部). 然后探测Rab7或Rubicon免疫复合物中所指示的蛋白质。Rubicon和Rab7的归一化结合被量化为结合/输入的相对比率（B/I）。对照细胞中的B/I设置为1.0。(B类)Rab7的过度表达降低了UVRAG–Rubicon相互作用。Rab7在HEK293T细胞中表达。然后用抗Rubicon抗体对得到的细胞裂解物进行免疫沉淀。对结合组分和输入组分进行检测，以确定所示的蛋白质。(C类)GTP–Rab7在体内与Rubicon和UVRAG竞争。表达不同形式的Rab7（WT、T22N、Q67L），并用抗UVRAG抗体免疫沉淀产生的细胞裂解物。对所示蛋白质的结合和输入进行了探测。(D类)重组纯化GST标记的Rab7 WT及其突变体大肠杆菌用10%SDS/PAGE进行分析，然后用考马斯蓝染色。(E类)Rubicon、UVRAG和不同形式Rab7之间的体外竞争。Rubicon-Flag-His（0.1μM）首先与Ni柱结合，然后与UVRAG-Flag（0.1μM）孵育，形成Rubicon–UVRAG复合物。不同浓度（0.1、0.5、2μM）的Rab7蛋白与Rubicon–UVRAG复合物孵育。结合蛋白用抗Flag和抗Rab7抗体进行Western blotting分析。
图4。
图4。
Rubicon定位于成熟的早期内体。(一个)Rubicon定位于成熟的早期内体。U型2表达Rubicon-Flag的OS细胞转染GFP-Rab5-WT、GFP-Rap5-S34N或GFP-Rab 5-Q79L，并在荧光显微镜下观察。Cy3缀合的M2抗体用于标记Rubicon-Flag。（比例尺：5μm）Rab5 Q79L表达细胞的框架区域扩大(底部). (B类)Rab7 GTP结合形式破坏了Rubicon–UVRAG的重叠。模拟转染：GDP结合的Rab7 T22N或GTP结合的Rab7 Q67L与GFP–UVRAG和Rubicon-Flag在U2OS细胞。在荧光显微镜下观察UVRAG（绿色）和Rubicon（红色）的亚细胞定位。(C类)对UVRAG和Rubicon阳性的细胞点状点的数量进行计数并绘制B类.
图5。
图5。
Rubicon从C-VPS/HOPS中隔离UVRAG并负调节Rab7的激活。(一个)Rubicon耗竭促进UVRAG和C-VPS/HOPS之间的相互作用。Rubicon WT或敲除（KD）U的细胞裂解物2用抗UVRAG抗体免疫沉淀OS细胞。检测到指示的蛋白质。(B类)Rubicon过度表达降低了UVRAG与C-VPS/HOPS的结合。用Rubicon-Myc或单独载体转染HEK293T细胞。用抗UVRAG抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀。检测到指示的蛋白质。(C类)潞碧垦枯竭刺激Rab7-RILP相互作用。在由WT或Rubicon RNAi缺失细胞制备的细胞裂解液中，对Rab7进行免疫沉淀，并对产生的免疫复合物进行Rab7和RILP检测。收集前用3-MA（10 mM）处理Rubicon WT和耗尽细胞8小时。(D类)Rubicon的消耗促进了Rab7–Vps41的相互作用。在由WT或Rubicon RNAi缺失细胞制备的细胞裂解液中，对Rab7进行免疫沉淀，并对产生的免疫复合物进行Rab7和Vps41的检测。
图6。
图6。
Rubicon的耗竭通过内吞途径改变EGFR的降解。(一个)在缺乏Rubicon的细胞中EGFR降解加速。在Rubicon RNAi缺失的293T细胞中检测EGFR降解。细胞在仅含DMEM的培养基中无血清培养10 h，然后添加200 ng/mL EGF以启动EGFR降解。在指定的时间点收集细胞，并通过Western Blotting检测EGFR水平。(B类,D类、和F类)EGFR水平一个,C类、和E类用荧光成像仪定量，并通过计算初始受体含量的百分比进行归一化。(C类)在Rubicon过表达细胞中测试EGFR降解。(E类)在单独表达载体Rubicon WT或Rubicon-ΔCT的Rubicon-deficied 293T细胞中检测EGFR降解。(G公司)EGFR积聚在Rubicon过度表达细胞的大液泡中。在U方向2单独表达载体或Rubicon的OS细胞，用抗EGFR抗体免疫染色检测内源性EGFR定位。（比例尺：5μm）(H（H）)计算并绘制细胞中直径大于800 nm的液泡数量(G公司).
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参考文献

    1. 诺丁汉RM，Pfeffer SR.定义边界：Rab GEF和GAP。美国国家科学院院刊2009；106:14185–14186.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Spang A.关于早期内体的命运。生物化学。2009;390:753–759.-公共医学
    1. Zerial M，McBride H.Rab蛋白作为膜组织者。Nat Rev摩尔细胞生物学。2001;2:107–117.-公共医学
    1. Wickner W，Haas A.酵母同型液泡融合：细胞器运输机制的窗口。生物化学年度收益。2000;69:247–275.-公共医学
    1. Rink J，Ghigo E，Kalaidzidis Y，Zerial M.Rab转化作为从早期到晚期内体进展的机制。单元格。2005;122:735–749.-公共医学

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