Quality control for unfolded proteins at the plasma membrane

doi:10.1083/jcb.201006012

.2010年11月1日；191(3):553-70.

doi:10.1083/jcb.201006012。 Epub 2010年10月25日。

质膜未折叠蛋白的质量控制

Pirjo M Apaja公司¹, 徐海金（Haijin Xu）, Gergely L Lukacs公司

附属公司

PMID： 20974815
预防性维修识别码： PMC3003321型
内政部： 10.1083/jcb.201006012

质膜上未折叠蛋白质的质量控制

Pirjo M Apaja公司等。 J细胞生物学. 2010.

.2010年11月1日；191(3):553-70.

doi:10.1083/jcb.201006012。 Epub 2010年10月25日。

作者

Pirjo M Apaja公司¹, 徐海金（Haijin Xu）, Gergely L Lukacs公司

附属

¹加拿大魁北克省蒙特利尔市麦吉尔大学生理学系。

PMID： 20974815
预防性维修识别码：下午003321
内政部： 10.1083/jcb.201006012

摘要

细胞蛋白质的内稳态在很大程度上取决于末端受损多肽的处理。为了证明构象受损质膜（PM）蛋白的操作并阐明其质量控制的分子基础，我们构建了胞质区含有野生型或温度敏感性噬菌体λ结构域的CD4嵌合体。使用蛋白质组学、生物化学和遗传学方法，我们发现PM处λ结构域的热展开引发了Hsp40/Hsc70/Hsp90伴侣蛋白和E2-E3复合物的募集。由生物发光共振能量转移和免疫印迹监测的混合链多泛素化负责非天然嵌合体加速的内化、受损的再循环和运输依赖性溶酶体降解所需的内胚体分选复合物。突变多巴胺D4.4和加压素V2受体从PM中去除也存在类似的模式。这些结果概述了高等真核生物中的外周蛋白平衡机制及其对一类构象疾病发病机制的潜在贡献。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
**展开诱导CD4tl-λ的下调_C下午。**（A）膜栓和可溶性噬菌体λ模型蛋白示意图。（B） CD4tl和CD4tl-λ/λ的免疫印迹（IB）分析_C在37°C下CHX追踪1.5 h（底部）之前（顶部）或之后表达。CHX追踪前，在37℃或26℃培养瞬时转染COS7细胞。（C）热展开（37°C）或天然样（26°C）CD4tl-λ的间接免疫染色_C在非渗透（顶部）或渗透（底部）COS7细胞中。钙网蛋白被用作ER标记物。棒材，10µm。（D）嵌合体的PM密度由ELISA测定，如材料和方法中所述。（E）获救和随后展开的CD4tl-λ的药理学特征_C通过CHX追踪和免疫印迹测定降解。将乳酸胱氨酸（LAC）、康乃霉素（Con）和巴非霉素A1（Baf）与CHX同时添加3.5 h。NH₄氯和氯喹（Chl）在CHX追踪的最后2小时内出现。装载了等量的蛋白质。（F和G）在37°C（F）下或在26°C（G）下无去折叠的情况下，通过ELISA测定37°C下解救和随后展开的模型蛋白1.5小时的PM稳定性。（H）通过37°C下的抗体摄取监测未折叠和挽救模型蛋白的内化。数据以初始Ab结合的百分比表示。（一）回收效率由材料和方法中所述的生物素-链霉亲和素夹心试验测定，并以CD4tl的百分比表示。分子质量以千道尔顿为单位。所示数据代表平均值±SEM。

**图2。**
**展开启动CD4tl-λ的泛素化_C下午。**（A）用HRP-结合的P4D1抗Ub抗体通过免疫印迹法检测变性细胞表面免疫沉淀（cs-IP）分离的CD4嵌合物的泛素化_C–表达的细胞比CD4tl-λ表达的细胞获得。分子质量以千道尔顿为单位。IB，免疫印迹。（B）监测CD4tl-RlucII-λ泛素化的方法_C由BRET提供²体内试验。（C）温度降低的CD4tl-RlucII-λ_C（26°C）主要局限于PM，与钙网蛋白的共定位可忽略不计。在26°C下CHX追踪5小时前后进行间接免疫染色。棒材，5µm。（D）将26°C温度降低的细胞在40°C下孵育指定时间，CD4tl-λ的内化率_C和CD4tl-RlucII-λ_C通过37°C时Ab摄取量测定。（E） CD4tl-RlucII-λ的展开刺激_CBRET检测到泛素化²HEK293细胞共表达拯救的CD4tl-RlucII-λ_C和GFP²-Ub或GFP²-UbiAA在26°C下用CHX治疗5小时。布雷特²在存在5µM柯氏菌嗪400a的情况下进行测量。EPAC表达作为阳性对照。（F） BRET总结²E.BRET中显示的实验结果²在暴露于40℃5分钟之前或之后，在26℃培养的细胞上进行测量。虚线表示背景BRET²信号。epa、EPAC。所示数据代表平均值±SEM。

**图3。**
**CHIP和分子伴侣被招募用于未折叠CD4tl-λ_C下午。**（A和B）CHIP与未折叠CD4tl-λ相关_C在PM进行自然cs-IP，并用抗CHIP和抗HA Abs（A）探测沉淀物。在与所示构建物共转染并在26℃或37℃（B）培养的HEK293细胞中检测外源性CHIP-myc关联。（C）与CD4tl-λ相关的分子伴侣_C但不使用PM处的CD4tl-λ。如A中所述进行非变性cs IP并进行探测。分子质量以千道尔顿为单位。IB，免疫印迹。

**图4。**
**CD4tl-λ的细胞和生化表型_CCHIP失活后。**（A）显性负性（DN）E3和E2酶对CD4tl-λPM稳定性的影响_C在瞬时共转染的HEK293细胞中进行检测，并在37°C下追踪30分钟后通过细胞表面ELISA进行监测。图S3 D描述了CD4tl-λPM的稳定性（**，P<0.01；n个= 5). 虚线表示模拟转染细胞中嵌合体细胞的表面周转。（B） CHIP消融是通过慢病毒shCHIP在表达CD4tl-λ的T-Rex HEK293细胞中的Flp-in中完成的_C并通过免疫印迹法进行验证。在shCHIP细胞中检测到CHIP-myc过度表达。CHIP缺失对四环素反式激活产生不利影响，降低CD4tl-λ的诱导水平_C在shCHIP细胞中。（C） PM CD4tl-λ的泛素化水平_C通过变性cs-IP和免疫印迹检测。使用了三倍于shCHIP细胞。（D）内化CD4tl-λ的稳定性_C通过在4°C下用抗CD4抗体标记PM-resident嵌合体，并在37°C下在shNT和shCHIP细胞中追踪0–1 h来测量。沉淀抗体嵌合体复合物并进行免疫印迹。（E） CD4tl-λ的PM周转_C通过细胞表面ELISA检测对照细胞、shCHIP和CHIP-myc转染细胞。（F） CD4tl-λ_C在共表达CHIP-myc变异体的shCHIP细胞中追踪1小时后，测定CD4cc-UbAllRΔG（UbRΔG）PM的稳定性。（G） CD4tl-λ的内化率_C在37°C下，通过shCHIP细胞中的Ab摄取监测CHIP-myc的缺失或存在，持续5分钟。在2.5分钟内测量四聚体CD4cc-UbAllRΔG（UbRΔG）和转铁蛋白（Tf）的内吞作用。（H）通过FRIA测定小干扰NT和小干扰CHIP（siCHIP）中内化货物的平均水泡pH值细胞，如材料和方法中所述。将抗CD4抗体和FITC-Fab结合在冰上，并在37°C下追逐1小时后进行FRIA。NT，非靶向siRNA。CD4tl-Ub、CD63和右旋糖酐的溶酶体靶向性不受shCHIP的影响。分子质量以千道尔顿为单位。IB，免疫印迹。所示数据代表平均值±SEM。

**图5。**
**展开的CD4tl-λ_C在下午进行混合链多泛素化。**（A）天然和未折叠CD4tl-λ的Ub链构型_CPM和内体。CD4tl-λ的变性cs-IP_C在（a）26°C温度下进行救援（自然），（b）在37°C下展开救援嵌合体1.5小时，以及（C）在37℃培养细胞后进行。除b外，抗CD4抗体在4°C下结合，其中抗体标记在37°C下进行1.5 h。用抗Ub抗体探测沉淀。EGFP-λ的变性IP_C并且EGFP是通过抗EGFP抗体完成的。通过2µg单-Ub和0.2µg K63和K48连接的多-Ub链探测抗体特异性。星号表示非特异性抗体反应性。（B）可溶性EGFP-λ和-λ的泛素化_C在对暴露于26°C或37°C的细胞进行IP变性和免疫印迹后检测到。（C） EGFP-λ和-λ的关联_C通过非变性IP和免疫印迹检测内源性和外源性CHIP嵌合物。（D） EGFP的营业额-λ和-λ_C通过CHX追踪和免疫印迹法在对照细胞和shCHIP细胞中检测。分子质量以千道尔顿为单位。IB，免疫印迹。

**图6。**
**未折叠CD4tl-λ的溶酶体递送_C取决于ESCRT。**（A）用激光共聚焦荧光显微镜对含有转铁蛋白（Tf）和LAMP2的内化CD4嵌合体进行间接免疫定位。CD4嵌合体在37°C下用抗CD4抗体捕获标记20分钟，并在无抗体培养基中追踪1小时。棒材，5µm。（B–D）用FRIA测量含有内吞CD4嵌合物和对照货物的囊泡的pH值。在冰上用抗CD4 Ab和FITC-Fab标记内部嵌合物，并在37°C下追逐1小时（B）或指定时间（C和D）。在B中，显示了高斯分布（曲线）和平均囊泡pH（粗体数字）。在FRIA（D）之前，嵌合体在26°C下获救。（E）验证siRNA-处理细胞中的Tsg101（Tsg）、Hrs和Stam1缺失。（F）内化CD4tl-λ的稳定性_C在shNT、shHrs和shStam细胞中测量，如图4 D.IB，免疫印迹所示。（G） CD4tl-λ的平均囊泡pH_C其他货物在Tsg101、Hrs和Stam1耗尽的细胞中追踪1小时后确定。分子质量以千道尔顿为单位。所示数据代表平均值±SEM。

**图7。**
**PM中突变V2R和DRD4的处理依赖于CHIP和ESCRT。**（A）瞬时转染HEK-293细胞中Flag-DRD4和myc-V2R变体的细胞（顶部）和PM（底部）表达。如材料和方法中所述，测量免疫印迹和细胞表面密度。分子质量以千道尔顿为单位。开放箭头，复杂的糖基化形式。闭合箭头，核心糖基化形式。圆形，非糖基化形式。（B）通过37°C下的抗Flag或抗myc抗体和ELISA测定在PM组成性累积的GPCR的周转率。（C）通过抗体摄取试验测定DRD4s和V2Rs的内化。（D和E）如图6 B所示，在对照、shStam-或shHrs-表达细胞中追逐15–60分钟后，FRIA对DRD4和V2R变体进行后核细胞分类。所示数据表示平均值±SEM。

**图8。**
**CHIP-依赖性泛素化有助于PM中突变V2R和DRD4的处理。**（A） wt和M345T-DRD4的泛素化是通过使用抗Flag和P4D1抗Ub Abs使cs-IP变性来测量的，如图2A所示。开放箭头，复杂糖基化形式。（B）CHIP耗竭（shCHIP）对wt和M345T-DRD4在PM泛素化的影响，如A中所测shCHIP细胞中M345T-DRD4和W164S-V2R的内化和PM转换受阻，通过过度表达wt而非催化失活或TPR突变的CHIP-myc而恢复到突变表型。用细胞表面ELISA监测GPCR的内化和PM稳定性。Western blot显示CHIP-myc变异体的表达。分子质量以千道尔顿为单位。IB，免疫印迹。所示数据代表平均值±SEM。

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