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.2011年1月；85(1):606-20.
doi:10.1128/JVI.00767-10。 Epub 2010年10月20日。

基孔肯雅病毒诱导IPS-1依赖性先天免疫激活和蛋白激酶R非依赖性翻译关闭

劳拉·K·怀特 1, 蒂娜·萨利, 大卫·阿尔瓦拉多, 伊芙琳娜·加蒂, 菲利普·皮埃尔, 丹尼尔·斯特雷布罗, 维克托·德菲利皮斯
附属公司

基孔肯雅病毒诱导IPS-1依赖性先天免疫激活和蛋白激酶R非依赖性翻译关闭

劳拉·K·怀特等。 J维罗尔. 2011年1月.

摘要

基孔肯亚病毒（CHIKV）是一种引起关节炎的蚊子传播的甲型病毒，正在印度洋周围地区再次出现。尽管这种病毒构成了当前和潜在的危险，但我们对CHIKV相关抗病毒免疫反应的诱导和逃避却知之甚少。有鉴于此，我们研究了人类成纤维细胞对CHIKV的先天免疫反应，这是病毒复制和传播的一个明显体内靶点。我们发现，CHIKV感染导致转录因子干扰素调节因子3（IRF3）激活，随后IRF3依赖的抗病毒基因转录，包括β-干扰素（IFN-β）。IRF3通过病毒诱导的先天免疫信号途径激活，该途径包括适配器分子干扰素启动子刺激因子1（IPS-1）。然而，尽管这些基因的转录上调很强，但没有观察到相应蛋白质的翻译。我们进一步证明，细胞（而非病毒）基因的翻译在感染期间被阻断，尽管CHIKV被发现通过双链RNA传感器蛋白激酶R触发翻译分子真核启动因子亚基2α的失活，这种反应对于蛋白质合成的阻滞是不需要的。此外，在存在CHIKV的情况下，还观察到细胞RNA合成的总体减少，IRF3依赖性抗病毒基因的转录在感染后期出现特异性阻断。我们假设，在感染期间观察到的干扰素-β和抗病毒蛋白的缺失是由于CHIKV显示的逃避机制所致，该机制依赖于细胞蛋白合成的广泛阻断和抗病毒mRNA转录物合成的靶向阻滞。

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数字

图1。
图1。
CHIKV感染可触发IFN-β和ISG的MOI依赖性转录。原发性HFs在指定的MOI下用CHIKV感染24小时。所给出的值是通过qPCR测定的IFN-β、Viperin和ISG56mRNA表达相对于未处理细胞的倍数变化。这些数据代表了重复实验的结果。
图2。
图2。
CHIKV感染触发IRF3的Ser398磷酸化和核累积。（A） MOI为0.1、1和10的CHIKV感染后16小时，原发性HFs中IRF3 Ser398磷酸化。（B） 感染CHIKV（MOI=10）的原发性HFs感染后2至24小时内IRF3 Ser398磷酸化。（C） 通过qPCR对感染CHIKV（MOI=1）的HFs中的IFN-βmRNA进行4、8、16和24小时的定量PCR测定，相对于未处理细胞的折叠变化。
图3。
图3。
IRF3对CHIKV诱导的IFN-β/ISG转录至关重要。（A） 免疫印迹显示在存在或不存在稳定表达的NPro或瞬时转染的非特异性（NS）或IRF3定向siRNA的情况下HFs的GAPDH和总IRF3蛋白，如文中所述。（B） 在用干扰素β（1000 U/ml）、SeV感染（160 HA单位/ml）或CHIKV感染（MOI=10）16小时后，指示的细胞类型中IFN-β、ISG56或Viperin mRNA的积累。转染NS或IRF3定向siRNA后，HFs中也显示出CHIKV诱导的IFN-β，ISG56，或Viperen mRNA的累积。所示值是通过qPCR测定的相对于未处理细胞的mRNA折叠变化，代表了至少重复进行的实验。（C） 用SeV（160 HA单位/ml）、IFN-β（1000 U/ml）或CHIKV（MOI=10）治疗16小时后，HF中Mx1 mRNA的累积。所示值是qPCR测定的相对于未处理细胞的mRNA倍变化，是重复实验的代表。
图4。
图4。
HF的CHIKV感染通过IPS1导致dsRNA和IRF3依赖性转录的积累。（A） 间接免疫荧光显示感染后0、2、4、6和8小时CHIKV感染HFs（MOI=10）中的dsRNA。（B） 免疫印迹显示感染后24小时，在存在或不存在CHIKV感染（MOI=10）的情况下，使用NS或IPS1定向siRNA治疗HFs后，IPS1、Ser398-磷酸化IRF3、总IRF3和GAPDH水平。（C） 用NS或IPS1导向的siRNA治疗HFs后，通过qPCR检测IFN-β、Viperin和ISG56的转录诱导。这些细胞要么未感染，要么感染了SeV或CHIKV(▪; MOI=10），并在感染后24小时采集总RNA。呈现的值标准化为NS siRNA存在时的转录诱导值（设置为1），代表重复进行的实验。
图5：。
图5：。
HFs的CHIKV感染不会诱导IFN-α/β的分泌或ISG蛋白的合成。（A） 报告细胞在暴露于未经处理、用含有1000 U IFN-β/ml的培养基处理、感染SeV（160 HA单位/ml）或在指定MOI感染SINV或CHIKV的HF培养基24小时后，IFN-α/β依赖性荧光素酶的表达，并且每次处理将培养基转移到96孔板的6孔中的汇合的THF-ISRE中。给出的值是四个单独处理的平均发光读数±平均值标准误差（SEM）。（B） 在指定的MOI处用IFN-β、SeV或CHIKV处理24小时后，对Viperin、ISG56、GAPDH和CHIKV衣壳蛋白进行免疫印迹。
图6。
图6。
HFs的CHIKV感染导致细胞翻译关闭。免疫印迹显示，未经处理的HF或暴露于200μg环己酰亚胺（CHX）ml后，嘌呤霉素并入新合成的蛋白质中−1持续6小时或CHIKV（MOI=10）（顶部）、CHIKV衣壳蛋白（中部）和GAPDH（底部），持续指定的时间。
图7。
图7。
CHIKV感染和感染相关RNA诱导PKR磷酸化。（A） 免疫印迹显示在用CHIKV感染HFs达指定持续时间（左）后，Thr446、总PKR、CHIKV衣壳和GAPDH上磷酸化的PKR，以及未处理细胞中磷酸化的PKR与总PKR的密度比设置为1（右）。（B） 免疫印迹显示仅用转染试剂（TF）处理或用从感染CHIKV（MOI=10）的HFs中获得的总RNA转染6小时的HFs的磷酸化PKR、总PKR和GAPDH。
图8。
图8。
CHIKV诱导eIF2α的PKR依赖性磷酸化。免疫印迹显示HFs和HFs中PKR、Ser51-磷酸化eIF2α、总eIF2 a、CHIKV衣壳和GAPDH在未感染或感染CHIKV 24 h后稳定表达针对PKR的shRNA（顶部），亲代HFs中磷酸化eIB2α与总eIFα的相应密度比（顶部），和表达针对PKR的shRNA的HFs(▪) 在MOI为0（比率设置为1）、MOI为1、MOI 10和MOI为100（右）的情况下，响应CHIKV。
图9。
图9。
CHIKV相关的细胞翻译关闭发生在缺乏PKR的情况下。（A） 免疫印迹显示PKR、CHIKV衣壳、GAPDH和嘌呤霉素并入HFs中新合成的蛋白，在非特异性（NS）或PKR导向的siRNA转染后，未经处理或感染CHIKV 4、8、12或16小时，MOI为10。（B）免疫印迹表明PKR、ISG56、Viperin、CHIKV衣壳，未经处理、用poly（I:C）转染或感染CHIKV 24小时后，HF或HF-shPKR中的GAPDH。（C）暴露于未经治疗或感染SeV（160 HA单位/ml）或CHIKV（MOI=10）24小时的HFs或HF-sh PKR收集的培养基后，报告细胞中IFN-α/β依赖性荧光素酶的表达。治疗分四次进行，每次治疗将培养基转移至汇合THF-ISRE中的六个孔，每个孔96个钢板。给出的数值是四个单独处理±SEM的平均发光读数。
图10。
图10。
感染CHIKV或SINV会降低细胞转录水平。（A） （i）未经处理，（ii）暴露于5μg放线菌素D（ActD）ml的HF中生物素化（新合成）与总RNA的比率−1或（iii）在指定的持续时间内感染CHIKV或SINV（MOI=10）。从未经处理的细胞中获得的比率设置为1。（B） 显示RT-PCR扩增产物的琼脂糖凝胶，该扩增产物使用生物素化或非生物素化RNA组分作为模板，从HFs中获取，（i）未经处理，（ii）暴露于5μg ActD ml−1或（iii）用CHIKV或SINV（MOI＝10）感染6或24小时。
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