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.2010年12月17日；285(51):39888-97.
doi:10.1074/jbc。M110.128348。 Epub 2010年10月11日。

缺血再灌注损伤时肝细胞高迁移率族蛋白B1的释放是由组蛋白脱乙酰酶活性降低介导的

约翰·埃文科维奇 1, 宋伟秋, 张瑞林, 乔恩·卡迪纳尔, 拉杰夫·杜帕, 张乐盟（Lemeng Zhang）, 约翰·克鲁恩, 杰森·兹洛特尼基, 蒂莫西·比利尔, Allan Tsung先生
附属机构

缺血再灌注损伤时肝细胞高迁移率族蛋白B1的释放是由组蛋白脱乙酰酶活性降低介导的

约翰·埃文科维奇等。 生物化学杂志. .

摘要

缺血细胞动员和胞外释放核高迁移率族蛋白-1（HMGB1）激活肝脏缺血/再灌注（I/R）损伤后的炎症通路。在巨噬细胞等免疫细胞中，乙酰化的翻译后修饰似乎对HMGB1的活性释放至关重要。过度乙酰化将其平衡从主要的核位置转移到细胞溶质积累和随后的释放。然而，肝细胞等实质细胞控制其释放的机制尚不清楚。在本研究中，我们发现体内肝脏I/R后释放的血清HMGB1被乙酰化，体外暴露于氧化应激的肝细胞也释放乙酰化HMGB1。组蛋白脱乙酰化酶（HDAC）是一类酶，可去除乙酰基并控制组蛋白和各种细胞内蛋白质的乙酰化状态。乙酰化HMGB1水平升高，伴随着总核HDAC活性的降低，这表明HDAC活性受到抑制是肝细胞氧化应激后乙酰化HMGB释放增加的原因。我们确定亚型HDAC1和HDAC4在调节乙酰化HMGB1的释放方面至关重要。氧化应激时肝细胞核中HDAC1的激活降低。此外，用siRNA敲低HDAC1可促进HMGB1的易位和释放。此外，我们证明HDAC4在氧化应激下从细胞核穿梭到细胞质，导致细胞核中HDAC活性降低。总之，这些发现表明肝I/R后肝细胞中HDAC1和HDAC4活性降低是促进HMGB1超乙酰化和随后释放的机制。

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数字

图1。
图1。
HMGB1在热肝I/R损伤和缺氧时被乙酰化并释放。I/R后小鼠肝组织裂解物和血清的共免疫沉淀分析。将小鼠分为假手术组或I/R组。I/R组在热缺血60min后再灌注。所示斑点是具有类似结果的三个实验的代表。A类用抗乙酰抗体免疫沉淀缺血肝组织裂解物并免疫印迹HMGB1。抗兔IgG作为阴性对照。所示的印迹是具有类似结果的三个实验的代表。B类，I/R后小鼠血清样本的抗乙酰赖氨酸免疫印迹。CI/R后小鼠血清的联合免疫沉淀。样品用抗HMGB1拖出，用抗乙酰赖氨酸免疫印迹。然后剥离印迹并重新证明HMGB1。D类用抗乙酰赖氨酸抗体免疫沉淀1%低氧暴露的肝细胞全细胞裂解物，并免疫印迹HMGB1。所示的印迹是具有类似结果的三个实验的代表。电子缺氧刺激后细胞培养上清液的共同免疫沉淀（1%O2)用于乙酰化HMGB1。
图2。
图2。
肝脏I/R和缺氧后，核HDAC活性降低。 A类从缺血/再灌注小鼠肝脏中提取核蛋白。HDAC活性通过比色法测定。*，第页<0.05。所示的分析是具有类似结果的三个实验的代表。B类假手术和1 h I/R小鼠乙酰化（Lys-9和Lys-18）和总H3的Western blot。C，肝细胞暴露于缺氧（1%O2)1、4、8和24小时，分析核蛋白的HDAC活性。*，第页<0.05。所示的分析是具有类似结果的三个实验的代表。
图3。
图3。
抑制HDAC导致HMGB1的核-胞质易位和HMGB1释放。 A类用Crystal Violet染色检测1μ米美国运输安全管理局。B类、TSA处理后大鼠肝细胞上清液HMGB1的Western blot分析或500μ米H（H）202治疗。所示斑点是具有类似结果的三个实验的代表。C，TSA处理后细胞上清液的共免疫沉淀。用抗HMGB1免疫沉淀细胞并免疫印迹抗乙酰赖氨酸。所示斑点是具有类似结果的三个实验的代表。D类，大鼠肝细胞用1μ米TSA或500μ米H（H）202并对HMGB1进行染色。绿色HMGB1；蓝色，细胞核；红色，F-肌动蛋白。所示的图像是具有类似结果的三个实验的代表。电子肝细胞培养中HMGB1易位的高含量分析。对细胞进行HMGB1免疫染色，并使用细胞组学对细胞核和细胞质室中的染色强度进行量化TM公司Arrayscan®平台。使用Spotfire Decisisite软件确定“HMGB1易位阳性”和“HMGB1-易位阴性”细胞群。*，第页<0.05。F类10 m处理的原代大鼠肝细胞核和细胞质蛋白HMGB1的Western blot分析米HDAC抑制剂Scriptaid或其非活性类似物Nullscript，并受到缺氧（1%O2)针对不同的时间点。
图4。
图4。
HDAC1和HDAC4在小鼠肝细胞中表达。 A类，大鼠肝细胞中HDAC 1-9的RT-PCR。B类、小鼠肝细胞核蛋白提取物HDAC1和HDAC4的Western blot分析。Jurkat核提取物被用作HDAC1和-4的阳性对照。所示的印迹是具有类似结果的三个实验的代表。CI/R后对缺血肝组织核提取物进行Western blot分析。对磷酸化HDAC1和总HDAC1进行免疫印迹。所示的印迹是具有类似结果的三个实验的代表。D类小鼠肝细胞缺氧，通过Western blot分析pHDAC1和tHDAC1。所示的印迹是具有类似结果的三个实验的代表。
图5。
图5。
HDAC1的特异性抑制促进核HMGB1向细胞质的易位并增加HMGB1的释放。用扰乱的siRNA或HDAC1 siRNA转染小鼠肝细胞，并在转染后24小时进行RT-PCR(A类)或Western印迹(B类)转染后40h分析。所示斑点是具有类似结果的三个实验的代表。C，肝细胞转染10μ米40–48小时后通过免疫荧光染色分析HDAC1 siRNA。在正常缺氧或缺氧1、4和8小时后（1%O2)通过免疫染色。绿色HMGB1；蓝色，原子核。所示的图像是具有类似结果的三个实验的代表。D类，缺氧8h后转染HDAC1 siRNA的肝细胞上清液中HMGB1的Western blot。所示的印迹是具有类似结果的三个实验的代表。
图6。
图6。
在I/R期间，HDAC4从细胞核穿梭到细胞质。 A类，I/R期间肝细胞核和细胞质部分磷酸化HDAC4的Western blot分析。B类，再灌注1h时通过比色法测定的总HDAC活性。C,在体外，用500μ米H（H）202对磷酸化HDAC4和总HDAC4的细胞质组分进行Western blot分析。D类，肝细胞缺氧1h并进行磷酸化HDAC4染色。
图7。
图7。
I/R通过HDAC1失活和HDAC4穿梭诱导肝细胞释放乙酰化HMGB1。所提出的模型显示I/R后乙酰化HMGB1的释放。核HDAC1的去活化和HDAC4的细胞分裂梭动都有助于降低总的核HDAC活性，使HMGB1的乙酰化/去乙酰化平衡向净乙酰化和释放倾斜。
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