MicroRNA (miRNA)-mediated interaction between leukemia/lymphoma-related factor (LRF) and alternative splicing factor/splicing factor 2 (ASF/SF2) affects mouse embryonic fibroblast senescence and apoptosis

doi:10.1074/jbc.M110.114736

.2010年12月10日；285(50):39551-63.

doi:10.1074/jbc。M110.114736。 Epub 2010年10月4日。

微RNA（miRNA）介导的白血病/淋巴瘤相关因子（LRF）和选择性剪接因子/剪接因子2（ASF/SF2）相互作用影响小鼠胚胎成纤维细胞衰老和凋亡

洛雷娜·威尔杜西¹, 马塞拉·西米利, 米莲娜·里佐, 阿尔贝托·梅尔卡坦蒂, 莫妮卡·伊万杰利斯塔, 劳拉·马里亚尼, 朱塞佩·雷纳尔迪, 莱蒂齐娅·皮托

附属公司

PMID： 20923760
预防性维修识别码： PMC2998123型
内政部： 10.1074/jbc。M110.114736美元

微RNA（miRNA）介导的白血病/淋巴瘤相关因子（LRF）和选择性剪接因子/剪接因子2（ASF/SF2）相互作用影响小鼠胚胎成纤维细胞衰老和凋亡

洛雷娜·威尔杜西等。生物化学杂志. 2010.

.2010年12月10日；285(50):39551-63.

doi:10.1074/jbc。M110.114736。 Epub 2010年10月4日。

作者

洛雷娜·威尔杜西¹, 马塞拉·西米利, 米莲娜·里佐, 阿尔贝托·梅尔卡坦蒂, 莫妮卡·伊万杰利斯塔, 劳拉·马里亚尼, 朱塞佩·雷纳尔迪, 莱蒂齐娅·皮托

附属

¹意大利比萨国家医学院临床生理研究所基因与分子治疗实验室，邮编：56124。

PMID： 20923760
预防性维修识别码： 1999年8月23日
内政部： 10.1074/jbc。M10.114736号

摘要

白血病/淋巴瘤相关因子（LRF）是一种转录阻遏物，通过招募组蛋白脱乙酰化酶特异性抑制p19/ARF表达，从而发挥癌基因的作用。相反，在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中，LRF抑制导致p19ARF异常上调，导致增殖缺陷和过早衰老。我们最近发现LRF是由microRNA控制的。在这里，我们表明LRF通过抑制miR-28和miR-505作用于MEF增殖和衰老/凋亡，揭示了小RNA（miRNAs）在LRF上游和下游都起作用的调节电路。通过分析转染LRF特异性短干扰RNA的MEF的miRNA表达谱，我们发现miR-28和miR-505受到LRF的调节。据预测，这两种miRNA都靶向选择性剪接因子/剪接因子2（ASF/SF2），这是一种对细胞活力至关重要的丝氨酸/精氨酸蛋白。在脊椎动物中，ASF/SF2的缺失或失活可能导致基因组不稳定，并诱导G（2）细胞周期阻滞和凋亡。我们发现miR-28和miR-505通过直接结合ASF/SF2 3'-UTR来调节ASF/SF2。LRF降低导致ASF/SF2降低，这取决于miR-28和miR-505的上调。LRF/miR-28/miR-505/ASF/SF2轴各成员的改变影响MEF增殖以及衰老和凋亡细胞的数量。一直以来，随着MEF培养中细胞衰老的增加，轴受到协调调节。总之，我们发现LRF-依赖性miRNAs miR-28和miR-505通过靶向ASF/SF2控制MEF增殖和存活，并提示LRF-相关miRNAs-除了LRF-依存性p53控制的作用外，在细胞内稳态中还发挥着中心作用。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
**LRF下调修饰MEF中的全球miRNA谱。** 一，P2MEF细胞转染siRNA-LRF和干扰siRNA(*siRNA-Ct*). 为了验证转染的效果，通过Western blot测定LRF蛋白水平(*左侧面板*). 作为进一步的对照，进行qRT-PCR以测量*LRF公司*及其直接目标*第19页ARF*(*右侧面板*). 将从转染细胞中提取的RNA手动杂交到8.1版Exiqon miRCURY LNA阵列。bqRT-PCR分析进一步验证了5个Z-score>3 S.D.阳性的miRNA。U6用于数据归一化。qRT-PCR分析中报告的值是三个独立转染实验的平均值。**，第页< 0.01; ***,第页< 0.001.

**图2。**
**LRF减少影响*磅/平方英寸*和*附件11c*基因。** 一和b，miRNA定位和推测LRF结合位点的示意图*磅/平方英寸*(一)以及*ATP 11c*(b)基因。*灰色方块*、LRF结合位点。这个虚线图中显示了CpG岛的位置，该岛的跨度从−700到+500ATP11c型基因(b). 用siRNA-LRF和siRNA-Ct转染MEF。*c（c）*，48小时后，提取总RNA，并进行qRT-PCR以定量*ATP11c型*和*磅/平方英寸*抄本。d日转染LRF表达载体的HEK293细胞中的转表达分析*磅/平方英寸*基于启动子荧光素酶的载体*雷尼利亚*向量作为内部控制。顶部，在转染48小时后使用双荧光素酶报告分析系统测定启动子活性。底部，WT示意图并删除*磅/平方英寸*荧光素酶报告载体中克隆的启动子。*e（电子）*，用siRNA-LRF或siRNA-Ct转染HEK293细胞*磅/平方英寸*启动子萤光素酶载体*雷尼利亚*向量作为内部控制。所有实验均一式三份。**，第页< 0.01; ***,第页< 0.001.

**图3。**
**miR-28和miR-505通过直接结合其3′-UTR下调ASF/SF2。** 一，小鼠Sfrs1基因剪接变异体的示意图。描述了miR-28和miR-505的假定结合位点。顶部，的*虚线双箭头*显示了3′-UTR的克隆部分。底部，包含Sfrs1变异体1的3′-UTR的基因组区域的系统发育保守性。Vista用于在小鼠和人类的基因组序列之间进行成对比对。b，P2MEF转染80 n米miR-Ct、miR-28和miR-505。然后，在转染48 h后提取蛋白质，并进行ASF/SF2和微管蛋白的Western blot作为内部对照。顶部这是西方污点的一个例子。底部，如上所述进行的三个实验的密度计定量。带强度归一化为微管蛋白的带强度。*c（c）*，P2MEF用80n转染米诱饵-Ct(*d-Ct（d-Ct）*)、d-28和d-505。底部，提取蛋白质并通过Western blot进行分析，如*b.顶部*这是西方污点的一个例子。d日、转染ASF-UTR载体的HK293细胞中的相对GFP荧光（EGFP-C1载体包含GFP基因融合到WT ASF/SF2 3′-UTR）、mut-28和mut-505（分别包含在miR-28和miR-505的种子匹配中突变的ASF/SV2 3′-UTR）。*，第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页< 0.001.

**图4。**
**LRF通过miR-28和miR-505调节调节ASF/SF2。** 一用siRNA-LRF和siRNA-Ct转染MEF。48 h后，评估LRF和ASF/SF2蛋白水平。b，MEF与si-Ct、siRNA-LRF+d-Ct、siRNA-LRF+d-28或siRNA-LF+d-505联合转染。顶部和底部48小时后，提取蛋白质和LRF(顶部)和ASF/SF2(底部)被量化。数据是三个实验的平均值。用对照质粒转染MEF(*pCMV公司*)和LRF表达载体(*对LRF*)使用Amaxa核电穿孔装置。纳秒，不显著。*c–e类*48小时后，LRF和ASF/SF2蛋白质水平(*c（c）*)、LRF和ASF/SF2亚型1 mRNA水平(d日)和miRNA水平(*e（电子）*)进行了评估。*，第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页< 0.001.

**图5。**
**在培养的MEF连续传代过程中，LRF/miR-28/miR-505/ASF/SF2轴被调制。** 一MEF传代中LRF和p19ARF的Western blot密度定量和qRT-PCR定量。b和*c（c）*，Western blot的密度定量(b)和qRT-PCR定量(*c（c）*)在MEF通道中的ASF/SF2。b,顶部ASF/SF2的Western blot分析示例。d日和*e（电子）*，qRT-PCR定量miRNA(d日)以及*磅/平方英寸*和*附件11c*MEF通过期间的抄本(*e（电子）*).

**图6。**
**LRF/miR-28/miR-505/ASF/SF2轴失调的生物学后果。** *a–f*，P2MEF转染siRNA-Ct，siRNA-LRF(一)，siRNA-ASF(b)，miR-28(*c（c）*)，miR-505(d日)、d-Ct和d-28(*e（电子）*)和d-505(*（f）*). 48小时后，将细胞进行胰蛋白酶化并接种进行“实验程序”中所述的不同分析。“图表显示了增殖、衰老和凋亡细胞数量的倍数变化（阴性和阳性）。每个值都是通过除以si-LRF转染的细胞百分比获得的(一)，si-ASF/SF2(b)，miR-28(*c（c）*)和miR-505(d日)与用si-Ct转染的细胞或用d-28转染细胞的百分比进行分割的细胞(*e（电子）*)和d-505(*（f）*)与转染d-Ct的细胞*a–d*根据siRNA-Ct计算，而*e（电子）*和*（f）*根据d-Ct.*计算，第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页< 0.001.

**图7。**
**miR-28和miR-505过度表达对Ich-1和Bcl-x选择性剪接的调节。** 一和d日，Ich-1替代拼接的示意图(一)和Bcl-x(d日)基因。用siRNA-Ct、miR-28和miR-505转染P2MEF。48小时后，提取总RNA并制备cDNA。可选拼接Ich-1(b)和Bcl-x(*e（电子）*)用小鼠特异性引物对产物进行RT-PCR检测。底火位置由*小箭头*在中下部属于*面板a*和*d.抄送*和*（f）*，三个实验的密度定量，如中所述b和*e（电子）*。值表示为S/L比，并使用Optiquant程序获得。*，第页< 0.05; **,第页< 0.01.纳秒，不显著。*S公司*和我短亚型和长亚型。

**图8。**
**LRF/miR-28/miR-505/ASF/SF2轴的拟定作用（修改自参考文献8）。**LRF上调或下调所诱导的miR-28和miR-505的调节影响ASF/SF2水平，并加强LRF在MEF增殖、衰老和凋亡中的作用。虚线表示失去压制。*较小的表单*表示蛋白质/miRNA减少。

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