E-cadherin antagonizes transforming growth factor β1 gene induction in hepatic stellate cells by inhibiting RhoA-dependent Smad3 phosphorylation

doi:10.1002/hep.23931

.2010年12月；52(6):2053-64.

doi:10.1002/hep.23931。 Epub 2010年10月1日。

E-cadherin通过抑制RhoA依赖性Smad3磷酸化拮抗肝星状细胞转化生长因子β1基因的诱导

伊尔·杰·乔¹, 年轻的Woo Kim, Chang Yeob Han先生, 金恩贤（Eun Hyun Kim）, 理查德·安德森, Young Sok Lee公司, 李昌浩, 黄世进, Sang Geon Kim先生

附属公司

PMID： 20890948
预防性维修识别码：项目经理3086490
内政部： 10.1002/庚23931

E-cadherin通过抑制RhoA依赖性Smad3磷酸化拮抗肝星状细胞转化生长因子β1基因的诱导

伊尔·杰·乔等。肝病学. 2010年12月.

.2010年12月；52(6):2053-64.

doi:10.1002/hep.23931。 Epub 2010年10月1日。

作者

伊尔·杰·乔¹, 年轻的Woo Kim, 张耀汉, 金恩贤（Eun Hyun Kim）, 理查德·A·安德森, Young Sok Lee公司, 李昌浩, 黄世进, Sang Geon Kim先生

附属

¹韩国首尔国立大学药学院和药学研究所代谢性和炎症性疾病创新药物研究中心。

PMID： 20890948
预防性维修识别码：项目经理3086490
内政部： 10.1002/庚23931

摘要

钙粘蛋白介导细胞间粘附和连环蛋白（ctn）相关的信号通路。肝纤维化伴随着E-cadherin（ECAD）的丢失，ECAD促进上皮-间质转化过程。目前，没有关于ECAD在肝星状细胞激活中的抑制作用的信息。由于ECAD具有抑制转化生长因子β1（TGFβ1）诱导的潜力，我们研究了ECAD过度表达是否阻止TGFβ2基因诱导；我们还研究了其分子基础。ECAD的强制表达降低了α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白水平，并导致TGFβ1基因及其下游基因的组成性和诱导性表达降低。ECAD过表达降低Smad3磷酸化，轻微降低Smad2磷酸化，从而抑制TGFβ1或Smad3过表达处理诱导的Smad报告活性。ras同源基因家族a（RhoA）的显性阴性突变体的过度表达降低了TGFβ1诱导自身基因诱导的能力。一贯地，用RhoA的组成活性突变体转染逆转了ECAD对TGFβ1诱导或Smad3诱导报告活性的抑制。使用ECAD突变体构建物的研究表明，ECAD的p120-ctn结合域负责TGFβ1的阻遏。一贯地，ECAD能够结合p120-ctn，从而招募RhoA；这阻止了TGFβ1增加RhoA介导的Smad3磷酸化。在轻度或重度纤维化患者的肝脏样本中，ECAD的表达与纤维化的严重程度相互关联。

结论：我们的结果表明，ECAD通过在p120-ctn结合域向p120-ctn招募RhoA来抑制Smad3/2磷酸化，而钙粘附素转换导致的ECAD丢失促进TGFβ1及其靶基因的上调，并促进肝纤维化。

PubMed免责声明

利益冲突声明

潜在利益冲突：无需报告。

数字

图1
ECAD对αSMA和vimentin。（A）纤维化肝脏的ECAD丢失。复制用载体（顶部）或DMN（10）处理过的大鼠的肝脏切片μL/kg体重，每周腹膜内注射3次，持续4周；底部）对ECAD进行免疫化学染色，αSMA或GFAP（红色）。箭头和箭头表示ECAD的强烈强度，αSMA和GFAP。中间一栏中的箭头显示α血管平滑肌周围SMA的表达。这些图片是来自至少六个独立实验的代表性图像。比例尺代表20（左右）或50μm（中间）。（B） HSC中的Cadherin切换。原代HSC在生长培养基中培养6或12天，细胞裂解物（30μg）进行免疫印迹（左）。ECAD和NCAD的表达水平也在HepG2细胞、原代肝细胞或静止HSC（上皮型）的裂解液中以及活化HSC、LX-2细胞或MEF细胞（间充质型；右）的裂解物中测定。（C）实时PCR分析。这些数据是至少六个独立实验的平均值和标准误差（与第0天相比有显著差异：***P（P）*< 0.01). （D）强制ECAD过度表达对αSMA和波形蛋白水平。用腺病毒重组ECAD感染HSC和LX-2细胞（感染倍数=50）。以腺病毒GFP为对照。结果由三个单独的实验证实。（E）腺病毒重组ECAD感染LX-2细胞的实时PCR检测（与腺病毒GFP感染显著不同：***P（P）*<0.01和**P（P）*< 0.05).

图2
ECAD对TGF的影响β1及其靶基因反式激活。（A）抑制基础TGFβ1 ECAD基因表达。用TGF转染MEFβ1荧光素酶构建物与编码ECAD或NCAD的构建物（模拟转染的pCEP4）结合。LX-2细胞或HSC被腺病毒GFP或ECAD感染。荧光素酶的活性通过β-半乳糖苷酶。（B）实时PCR分析。TGF公司β在稳定转染ECAD的MEF中测量1 mRNA水平。（C）报告基因活性。（D）用ECAD稳定转染的MEFs的实时PCR分析。这些数据是至少三个单独实验的平均值和标准误差（与模拟转染或腺病毒GFP感染相比有显著差异：***P（P）*<0.01和**P（P）*< 0.05).

图3
ECAD对TGF的影响β1-诱导报告基因活性。（A） TGF公司β1个报告基因活性。用TGF处理细胞β1（5 ng/mL，持续12小时）。（B） Smad记者活动。将ECAD瞬时转染的MEF或LX-2细胞与SBE-驱动的报告构建物结合，用TGF处理β1持续12小时。在稳定转染ECAD的MEF中也测量了报告活性。数据是三个独立实验的平均值和标准误差（与模拟转染相比有显著差异：**P（P）*<0.05和***P（P）*< 0.01).

图4
ECAD过度表达对Smad活性的影响。（A）磷酸化Smad3和Smad2的免疫印迹。用TGF处理稳定转染ECAD的MEF或感染ECAD的LX-2细胞β1（5纳克/毫升）。（B） Smad和TGFβ1个报告基因活性。数据是三个独立实验的平均值和标准误差[与模拟转染（左）或Smad3转染（右）相比有显著差异：***P（P）*< 0.01].

图5
RhoA与ECAD抑制Smad活性的关联。（A） C3毒素对Smad3/2磷酸化和Smad-driven报告活性的影响。在用TGF处理的LX-2细胞中测量磷酸化Smad3/2的水平β在细胞渗透性C3毒素处理4小时后1小时。（B） DN RhoA对转化生长因子的抑制作用β1-诱导型转化生长因子β1名记者或Smad记者活动。在用TGF处理的LX-2细胞中测量荧光素酶活性β1转染后12小时。（C） RhoA抑制抑制Smad3诱导的SBE报告活性。在Smad3转染后用C3毒素处理或用DN-RoA转染的细胞的裂解物上测量SBE萤光素酶活性。（D） CA-RhoA逆转ECAD抑制TGF的能力β1-诱导SBE荧光素酶活性。（E）通过CA-RhoA逆转ECAD抑制Smad3诱导的SBE荧光素酶活性的能力。数据是三个独立实验的平均值和标准误差（与模拟转染相比有显著差异：***P（P）*< 0.01).

图6
ECAD突变体对TGF表达的影响β1个基因或其靶基因。（A） TGF公司β1荧光素酶活性。示意图显示了主要的蛋白质结合域。基础TGFβ用ECAD的每个突变体构建物瞬时转染MEF细胞，测量1个报告者的活性。（B）报告基因活性。数据是至少三个单独实验的平均值和标准误差（与模拟转染相比有显著差异：***P（P）*< 0.01). 缩写：NS，不重要。

图7
ECAD通过p120-ctn结合与RhoA的相互作用。（A） IP-IB分析。对ECAD免疫沉淀物进行p120-ctn免疫印迹。为了评估蛋白质相互作用，对RhoA免疫沉淀物进行p120-ctn或ECAD免疫印迹；10%的总裂解物用作输入对照。K18作为阴性对照。（B）通过p120-ctn将ECAD与RhoA关联。用ECAD或ECAD–Δp120-ctn转染LX-2细胞。（C） RhoA活性测定。用TGF处理LX-2细胞，测定RhoA活性βECAD感染后15分钟。（D） p120-ctn敲除对ECAD抑制RhoA能力的影响。用腺病毒ECAD构建物感染LX-2细胞，转染p120-ctn-siRNA，然后暴露于TGFβ1.（E）RhoA与ECAD和RhoA活性的结合。在第0天和第12天在HSC中测量RhoA和ECAD之间的相互作用（左）以及RhoA活性（右）。（F） p120-ctn敲除对TGF的影响β1-诱导型Smad3磷酸化。这些数据是至少三个单独实验的平均值和标准误差（与用TGF治疗的GFP感染细胞相比有显著差异β1). 缩写：IB，免疫印迹；IgG、免疫球蛋白G；IP，免疫沉淀；K18，细胞角蛋白18；NS，不显著。

图8
ECAD表达与纤维化。（A）轻度纤维化（Ishak纤维化评分≤2）或重度纤维化（Ishak纤维化=6）患者的ECAD表达。对肝脏切片（每组9名患者）进行H&E和ECAD染色（红色）和αSMA（绿色）免疫组织化学。这些图片是有代表性的图片。比例尺代表50μm.使用图像分析软件在肝脏切片上测定ECAD的面积分数（%）。数据为平均值和标准误差（n=9；与轻度纤维化相比差异显著）。（B） ECAD预防Smad3依赖性TGF的拟议信号通路β1基因诱导。缩写：H&E、苏木精和曙红。

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