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.2010年11月15日；21(22):3998-4008.
doi:10.1091/mbc。E10-05-0457。 Epub 2010年9月22日。

Golgi-endosomal系统向酵母自噬体的膜传递

大桥洋平 1, 肖恩·蒙罗
附属公司

Golgi-endosomal系统向酵母自噬体的膜传递

大桥洋平等。 分子生物学细胞. .

摘要

虽然自噬所需的许多蛋白质已被鉴定，但自噬体膜的来源仍未确定，内质网（ER）、内体和线粒体均已被激活。完整的膜蛋白Atg9在饥饿期间被传递到自噬体，并在酵母中组成的相关细胞质-空泡（Cvt）途径中被传递。我们检查了将含有Atg9的膜传递到酵母自噬体的要求。Atg9似乎并非来源于线粒体，并且Atg9不能直接从内质网或早期高尔基体到达形成的自噬体。已知高尔基体和内体之间的交通成分是Cvt途径所必需的，但在饥饿细胞中似乎不需要自噬。然而，我们发现Golgi-endosomal交通成分突变的成对组合显然只需要Cvt通路，可以导致Atg9传递和饥饿细胞自噬的严重缺陷。因此，含有Atg9的膜似乎是从Golgi-endosomal系统而不是从ER或线粒体传递到自噬体的。这被单个突变体的检测低估了，为酵母和哺乳动物对Atg9定位和自噬小体形成的研究之间的差异提供了可能的解释。

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数字

图1。
图1。
Atg9不能直接从内质网到达形成的自噬体。（A） 表达GFP-Atg9的酵母的荧光显微照片，其C末端myc标记后无任何内容或RXR基序[KLRRRI（Michelsen等。, 2007)]. 融合用来自着丝粒载体的TPI1启动子表达，细胞也表达RFP-Ape1或ER蛋白RFP-Scs2。RXR基序增加了内质网中Atg9的数量，减少了mRFP-Ape1聚集体中Atg8的数量。比例尺=2μm。（B） 野生型细胞或自动液位计9用空质粒或A中所示的相同GFP-Atg9质粒转化的缺失菌株，以及一种具有C末端myc标签、后面跟着KKXX基序（SKKSL）的缺失菌株。细胞在富培养基中生长后或氮饥饿四小时后收获，以诱导自噬。在这两种条件下，RXR基序与Atg9的连接都会阻断其活性。（C） 表达GFP-Atg8的细胞裂解产物的抗-GFP免疫印迹自动液位计8CEN质粒上的启动子。酵母菌株如A和B中所示，但带有自动液位计9融合整合到基因组中。细胞生长到中期，收获（0）或饥饿氮气4小时。Atg9的缺失会阻止GFP-Atg8传递到液泡并释放游离GFP。（D） 表达细胞溶质形式的Pho8（Pho8Δ60）的菌株中的碱性磷酸酶活性缺乏跨膜结构域，因此只有在通过大量自噬传递到液泡时才会激活（Noda和Ohsumi，1998）。应变与C中相同，但具有电话13已删除和电话8截断为电话8Δ60通过积分TDH3型发起人。细胞在C中生长并饥饿4小时（误差条表示三个独立实验的SD）。
图2。
图2。
Atg9-GFP的细胞内分布。（A） 如图所示，在野生型细胞或缺乏线粒体融合蛋白Ugo1的细胞中，比较Atg9-GFP和线粒体外膜标记Tom20-RFP的荧光显微照片，这些细胞生长在YEPD中，或饥饿四小时[SD（-N）]。Ugo1的丢失导致线粒体形成碎片团块（Sesaki和Jensen，2001），但Atg9-GFP仍然分散，仅偶尔观察到共定位，通常在形成芽时。（B） 荧光显微照片，将Atg9-GFP与富含培养基的野生型细胞中的晚期高尔基体蛋白Sec7-RFP或晚期内体蛋白Nhx1-RFP进行比较。（C） 在富含培养基的野生型细胞中比较Atg9-GFP与RFP-Ape1、内吞示踪剂FM4-64（10分钟脉冲，10分钟追踪）或mCherry-Tlg1（Chry-Tlg1）的荧光显微照片。（D） 至于C，除了细胞要么缺乏自噬体支架蛋白Atg11，这是膜在自噬体积累所必需的（Shintani和Klionsky，2004），要么缺乏内吞区室扩张的内体蛋白Vps4（Babst等。, 1997).
图3。
图3。
高尔基SNARE和COG亚单位参与Cvt途径。（A） 在富培养基（YEPD）中生长三小时或在氮饥饿条件下生长四小时的SNARE突变体的Ape1免疫印迹分析[SD（-N）]。Vam3和Vam7参与液泡膜的融合，因此是Ape1在营养和饥饿条件下成熟所必需的。Pep12的缺失抑制了Ape1的成熟，这至少部分是因为它在液泡水解酶传递中的已知作用（Becherer等。, 1996). 在饥饿的细胞中，空泡内未消化的自噬小体中可以看到一些GFP-Ape1（补充图1B），但在富培养基中，我们也观察到靠近空泡的GFP-Ape 1聚集体的积聚，因此在Cvt途径中自噬体的形成也可能有缺陷。（B） 通过荧光显微镜在所示菌株中定位GFP-Ape1。细胞在YEPD或SD（-N）中生长，并用FM4-64标记。在YEPD中，4%的野生型细胞中观察到GFP-Ape1的点状突起，但在Δatg1（31%）、Δcog8（29%）、△gos1（12%）和Δtlg2（24%）中增加。在SD（-N）中，除Δatg1外，所有菌株的GFP信号主要出现在液泡内。（C） 野生型（WT）或指示缺失突变体的Ape1免疫印迹分析。缺乏COG叶B亚单位的突变，或YPT6型或其交换因子RIC1（风险、信息、理赔及代收）仅在营养期（YEPD），Ape1成熟度降低。
图4。
图4。
高尔基体内体突变的组合导致自噬缺陷。通过免疫印迹法对所示突变体中的YEPD和SD（-N）中的Ape1成熟度进行分析。（A） 分析Δcog8和两个SNARE突变体Δgos1和Δtlg2。（B） 分析三个相关排序连接蛋白Atg20、Atg24和Snx41的Δcog8和单个突变体。（C） 两个SNARE突变体（Δgos1和Δtlg2）和两个排序连接蛋白突变体的分析。
图5。
图5。
Cvt途径突变的组合会导致自噬缺陷。通过免疫印迹法对所示突变体中的YEPD和SD（-N）中的Ape1成熟度进行分析。（A） 分析缺乏GARP/VFT亚单位Vps51或Ypt6的突变体，这些突变体招募GARP/VFT，以及排序连接蛋白（Δatg20和Δatg 24）。（B） Cvt组分Atg21和排序连接蛋白（Δatg20和Δatg 24）突变分析。（C） TRAPP亚基Gsg1和排序连接蛋白Atg24的突变分析。
图6。
图6。
Golgi-endosomal组分中的组合突变体在饥饿诱导的自噬中表现出协同缺陷。（A） 表达GFP-Atg8的指示菌株的抗-GFP免疫印迹。细胞在没有尿嘧啶（富培养基）的情况下生长到生长中期，然后收获或转移到饥饿条件下4小时（SD-N）。GFP-Atg8的位置和自噬输送到液泡后释放的游离GFP的位置都被显示出来。（B） 表达Pho8Δ60的指示菌株中的碱性磷酸酶活性缺乏跨膜结构域，因此只有通过自噬传递到液泡后才会激活。饥饿和紧张（电话13删除）如A所示，误差条表示三个独立实验的SD。（C） 定量GFP-Atg8在A中生长的细胞中的分布。对每个菌株>150个细胞进行计数。这些值显示了具有一个或多个GFP-Atg8点的群体的比例，并且基于六个焦平面的投影。在所有双突变体中，具有多个GFP-Atg8点的细胞的频率增加具有统计学意义（χ2检验，双尾值p<0.0001）。（D） 在C中量化的细胞的代表性单焦平面图像。SNARE和Atg24突变的组合导致GFP-Atg8出现多个点状突起，与自噬体形成缺陷一致。
图7。
图7。
在Golgi-endosomal贩运成分的双突变体中，Atg9未到达包含Ape1的自噬体。（A） 荧光显微照片比较了Atg9-GFP和RFP-Ape1在YEPD或SD（-N）中指示的代表菌株中的分布。箭头表示未与Atg9-GFP共定位的RFP-Ape1点。（B） YEPD（富）和SD（-N）中Atg9-GFP和RFP-Ape1共定位的量化。对每个菌株50–100个包含RFP-Ape1的结构进行了检查。
图8。
图8。
Atg24的损失与不同SNARE的损失相结合会影响Atg9回收路线的不同部分。（A） 荧光显微照片，比较Atg9-GFP和RFP-Ape1在删除或不删除Atg1的指示菌株中的分布。细胞生长于YEPD中期，并在饥饿条件下培养4小时（SD-N）。Atg1的缺失阻止了Atg9从围绕Ape1聚集物形成的自噬体中退出（Reggiori等。，2004年a）。在缺乏Atg11的情况下，自噬体不会形成，因此这可以作为阴性对照。在Δgos1Δatg24中，大多数形成的自噬体在缺乏Atg1（箭头）的情况下显示Atg9的积累，而在Δtlg2Δatg 24中，形成的自吞噬体往往缺乏Atg9（箭头），这表明递送而非回收有缺陷。（B） 通过计算有多少Ape1聚集物与Atg9-GFP相关，定量A中Atg9在形成自噬体中的存在。对每种情况下的100–200 mRFP-Ape1 punta进行分析。
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参考文献

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