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.2010年9月20日；190(6):1023-37.
doi:10.1083/jcb.201003122。

α-突触核蛋白损伤大自噬：与帕金森病的关系

阿什利·温斯洛 1, 陈建文, 西尔维娅·科洛卡诺, 亚伯拉罕·阿塞韦多·阿罗泽纳, 大卫·E·戈登, 安德鲁·佩登, 梅克·利希滕贝格, 菲奥娜·曼齐斯, 布林达·拉维库马尔, 萨拉·伊马里西奥, 史蒂夫·布朗, 卡希尔·J·奥凯恩, 大卫·C·鲁宾斯坦
附属公司

α-突触核蛋白损伤大自噬：与帕金森病的关系

阿什利·温斯洛等。 J细胞生物学. .

摘要

帕金森氏病（PD）的病理特征是称为路易体的神经元内包涵体，主要由α-突触核蛋白组成。α-突触核蛋白基因座的扩增增加了α-突触核蛋白的表达并导致PD。因此，野生型α-突突核蛋白的过度表达是有毒的。在这项研究中，我们证明α-突触核蛋白过度表达会损害哺乳动物细胞和转基因小鼠中的宏观自噬。我们的数据表明，α-突触核蛋白通过抑制Rab1a而破坏自噬，而Rab1a-过表达可以挽救α-突触核蛋白引起的自噬缺陷。α-突触核蛋白过度表达或Rab1a敲除抑制自噬会导致自噬蛋白Atg9定位错误，并减少ω小体的形成。Rab1a、α-突触核蛋白和Atg9都调节着作为自噬体前体标志的omegasome的形成。

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数字

图1。
图1。
α-突触核蛋白的过度表达抑制了大细胞自噬。（A） 条形图显示α-突触核蛋白-GFP过表达对SKNSH、人神经母细胞瘤细胞中HA标记的httQ74聚集的影响（比值比；n个＝9）。注意，由于不同的细胞系、不同的转染条件（例如，httQ74是否与另一表达载体或siRNA一起转染）和时间，在不同的实验设置下，含有httQ74-聚集体的对照细胞的数量可能不同。因此，实验条件的相对变化很重要。（B） α-突触核蛋白过度表达对肿瘤标记p62的影响。在实验的最后24小时，以低水平转染番茄p62和DsRed（1.5:1），观察α-synuclein过度表达对p62的影响。DsRed被用作tomato-p62（双尾Student’st吨测试；n个= 3). （C） α-突触核蛋白过度表达对使用和不使用巴非霉素A1处理的LC3-II水平的影响。微管蛋白水平显示出相等的负荷。代表性数据集的密度测定(n个=3）显示有和没有巴非霉素（双尾学生t吨测试）。（D） 过度表达α-突触核蛋白–GFP的SKNSH细胞内源性LC3阳性斑点的免疫染色。第三栏中的方框在第四栏中放大，以更详细地显示高倍镜下自噬体数量的差异。显示的图像是z轴堆栈投影。棒材，20µm。（E） 指示α-突触核蛋白过度表达对LC3囊泡数的影响的条形图（双尾Student’st吨测试；n个= 20). （F） 通过SDS-PAGE评估来自野生型小鼠（+，+）和杂合型小鼠（+/M7）以及α-突触核蛋白转基因纯合型小鼠（M7）右半球脑裂解液中LC3-II水平。显示了具有代表性的样品。（G） 通过密度测定法定量F中相对于微管蛋白的LC3-II水平（单向方差分析和Bonferroni事后检验；n个= 3). （A–C、E和G）误差线代表SEM（*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001）。（H） α-synuclein（α-syn）的神经元表达；UAS-α-突触核蛋白)使用elav-Gal4驱动程序（elav-Gall4；埃拉夫155元)表达突变型亨廷顿蛋白外显子1（Q120）的果蝇的神经变性显著增加；gmr-Htt（外显子1）Q120)眼睛（*，与所有对照组比较，P<0.02；配对学生t吨测试；n个=5个独立实验，每个实验基于10个人中每个人的～15个小蜂）。误差条代表SEM。
图2。
图2。
α-突触核蛋白的过度表达抑制哺乳动物细胞的分泌并导致高尔基体碎裂。（A） 指示α-突触核蛋白-CFP过度表达对HeLa衍生报告细胞系（C1）组成性分泌的影响的条形图。Brefeldin A是一种已知的组成型分泌抑制剂，被用作阳性对照（*，P<0.05；双尾Student’st吨测试；n个= 3). 生长激素。（B） 过表达α-突触核蛋白–GFP的HeLa细胞内源性GM130（顺高尔基标记物）的免疫染色。图像是z堆栈投影。棒材，20µm。（C） α-突触核蛋白对高尔基体裂解作用的量化（***，P<0.001；比值比；n个= 6). （A和C）误差线代表SEM。
图3。
图3。
敲除Rab1a抑制大自噬。（A） 在HeLa细胞中敲低Rab1a并用巴非霉素A1处理后，通过SDS-PAGE评估LC3-II水平。肌动蛋白水平显示出相等的负荷。代表性数据集的密度测定(n个=3）显示有和没有巴非霉素（*，P<0.05；学生的t吨测试）。（B） 指示Rab1a敲除对httQ74-HA聚集的影响的条形图，如A所示（***，P<0.001；比值比；n个= 9). （A和B）误差条代表SEM。（C）组成活性Rab1（Rab1-CA；UASp-YFP公司。拉伯1.Q70L)在Rab1-CA存在和不存在的情况下，使用elav-Gal4驱动因子显著抑制表达突变亨廷顿蛋白外显子1（Q120；分别为5.0±0.12和4.1±0.06）的5-d龄苍蝇的神经变性；Student’st吨测试）。每只正常的苍蝇眼都含有数百只小蜂和七个可见的杆状体。这些图表显示了每种基因型每小粒的弹状体数量的分布。使用配对学生的t吨使用五到七个独立实验的数据进行测试，每个实验基于每个基因型的约10个个体，每个基因型都有15个小蜂被打分。（D） 显性负性Rab1（Rab1-DN；UAST-YFP。拉布1.S25N)在Rab1-DN存在和不存在的情况下，使用elav-Gal4驱动因子显著增强了表达突变亨廷顿蛋白外显子1（Q120；分别为4.1±0.1和5.2±0.1）的5-d龄苍蝇的神经变性；Student’st吨测试）。请注意，C和D之间的Q120 elav-Gal4苍蝇的神经退化程度可能不同，因为这些是独立的实验，持续时间不相同。
图4。
图4。
自噬并不依赖于调节分泌的所有Rab蛋白。（A） 为了测量Rab1a、Rab1b、Sar1A/B、Giantin和VDP的RNAi对组成分泌的影响，用与这些基因对应的siRNA转染HeLa衍生的C1细胞。使用流式细胞术测定诱导分泌80分钟后细胞中残留的GFP-生长激素的量。作为阳性对照，用STX5（syntaxin5）siRNA转染细胞，STX5是一种已知的分泌抑制剂(n个=3个独立实验；***，P<0.001；多重比较、单向方差分析、Dunnett的多重比较事后检验）。生长激素。（B） 敲除HeLa细胞中的Sar1A和-B、Giantin或VDP后，通过SDS-PAGE评估LC3-II水平。肌动蛋白水平显示出相等的负荷。（C） 条形图显示敲除对httQ74聚集的影响，如B中所示（**，P<0.01；***，P<0.001；比值比；n个= 9). （D） 在敲除的最后24小时内，将番茄p62和DsRed转染到HeLa细胞中，如B细胞，并通过SDS-PAGE测定其效果。DsRed被用作tomato-p62的转染对照。与DsRed相比，tomato-p62水平的量化如条形图所示（*，P<0.05；**，P<0.01；Dunnett的多重比较事后检验；n个= 3). 将值标准化为单独实验的对照值。（E） 在敲除Rab1b（显示的条带来自同一凝胶，并且忽略了无关的条带）或Rab2后，通过SDS-PAGE评估LC3-II水平。肌动蛋白和微管蛋白水平显示出相等的负荷。（F） 条形图显示敲除（如E）对转染细胞中httQ74聚集百分比的影响（***，P<0.001；比值比；n个= 9). （G） 在敲除的最后24小时内，将番茄p62和DsRed转染到HeLa细胞中，如在E中，并通过SDS-PAGE测定其效果。DsRed被用作tomato-p62的转染对照。条形图显示了tomato-p62水平相对于DsRed的定量（**，P<0.01；Bonferroni的多重比较事后检验；n个= 3). 将数值归一化为单独实验的控制值。（A、C、D、F和G）误差线代表SEM。
图5。
图5。
Rab1a可以拯救α-突触核蛋白对大细胞自噬的影响。（A） 用空CFP载体（对照条件）或Rab1a-CFP（挽救条件）表达α-突触核蛋白-HA的细胞对SKNSH细胞中的tomato-LC3囊泡的影响。使用带有23个多聚谷氨酰胺重复序列（httQ23）的HA标记野生型（wt）亨廷顿蛋白外显子1片段作为在对照和救援条件下表达α-突触核蛋白-HA的细胞的对照。我们在这些实验中使用了每个细胞20个小泡的截止值，因为LC3的瞬时转染增加了小泡的基线水平（与内源性LC3相比），20个小囊是在这些细胞的野生型条件下观察到的平均值。棒材，20µm。（B） 量化Rab1a-CFP对α-突触核蛋白依赖性LC3水平降低的影响（**，P<0.01；双尾Student’st吨测试；n个= 3). 误差条代表SEM。
图6。
图6。
α-突触核蛋白和Rab1a影响Atg9和LC3小泡的共定位。（A） α-synuclein过度表达或Rab1a敲除SKNSH细胞中Atg9和p230的内源性免疫染色。使用空的GFP载体（EGFP）作为表达α-突触核蛋白-GFP的细胞的对照。显示的图像是z堆栈投影。Atg9面板显示，随着α-synuclein过度表达或Rab1a敲除，核周定位明显分散。在p230列中可以看到高尔基体碎裂。α-突触核蛋白过度表达导致高尔基体结构紊乱增加，这是一种通过Rab1a敲除而扩增的表型。（这些图像的放大倍数已保存在JCB DataViewer中。）（B）用p230（皮尔逊系数；***，P<0.001；双尾Student’st吨测试；n个=10（来自一个代表性实验）。（C） α-synuclein过度表达或Rab1a敲除细胞内内源性Atg9和LC3的免疫染色。使用空GFP载体（GFP）作为表达α-突触核蛋白–GFP的细胞的对照。Colocalization在合并面板上以白色突出显示（图像由ImageJ Colocalisation插件生成）。图像是单共焦平面，用于更精确地确定共聚焦。箭头表示共同定位事件。（这些图像的放大倍数已保存在JCB DataViewer中。）（D和E）Atg9与LC3共定位的量化（皮尔逊[D]和曼德系数[E]）。当LC3囊泡数量因Rab1a敲除或α-突触核蛋白过度表达而减少时，E中第一个条形图中显示的Mander系数更准确地预测Atg9/LC3共定位（*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；双尾Student’st吨测试；n个= 10). （B、D和E）误差条代表SEM。参见相关图S3棒材：（A）20µm；（C） 10微米。
图7。
图7。
α-突触核蛋白、Rab1a和Atg9影响omegasome和自噬体的形成。（A） Rab1a和Atg9敲除对人类胚胎肾细胞DFCP1-GFP HEK293中omegasome形成的影响。（B） A的量化（*，P<0.05；单因素方差分析，Dunnett多重比较事后检验；n个= 10). （C） α-突触核蛋白对DFCP1-GFP HEK293细胞中omegasome形成的影响。httQ23-HA被用作表达α-突触核蛋白-HA的细胞的对照。（A和C）箭头表示Ω。所示图像为单平面图像。（D） C的量化（*，P<0.05；双尾学生t吨测试；n个= 10). （E） 用空CFP载体（对照条件）或Rab1a-CFP（拯救条件）表达α-突触核蛋白-HA的细胞对omegasome形成的影响。用带有23个多聚谷氨酰胺重复序列（httQ23）的HA标记野生型亨廷顿蛋白外显子1片段作为在对照和救援条件下表达α-突触核蛋白-HA的细胞的对照。显示Z堆叠投影。箭头表示ω。（F） E的量化（*，P<0.05；双尾学生t吨测试；n个= 10). （B、D和F）误差条代表SEM。（G）Atg9敲除对SKNSH细胞裂解物中LC3-II水平的影响。肌动蛋白被用来证明相等的负荷。棒材：（A和C）20µm；（E） 10微米。
图8。
图8。
α-突触核蛋白过度表达的累积分子效应。图示了细胞内α-突触核蛋白水平增加对重要细胞内途径的多效性影响。α-突触核蛋白对大细胞自噬的影响可能会导致对促凋亡损伤的敏感性增加、线粒体功能障碍和聚集增加，这些都是PD的特征。
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