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.2010年9月20日；190(6):1005-22.
doi:10.1083/jcb.200912089。

在自噬体生物发生的早期步骤中起作用的含有Atg9的小室

穆里尔·马里 1, 贾妮斯·格里菲斯, 埃斯特·里特, 拉克希米·克里希纳帕, 丹尼尔·克林斯基, 富尔维奥·雷吉奥里
附属公司

在自噬体生物发生的早期步骤中起作用的含有Atg9的小室

穆里尔·马里等。 J细胞生物学. .

摘要

真核生物利用自噬过程，在许多生理和病理情况下，以溶酶体/液泡降解为目标的结构被隔离在双层自噬体中。该领域的关键问题与膜的起源以及导致自噬体形成的重排的精确性质有关。我们发现，酵母Atg9集中在一个由小泡和小管簇组成的新隔室中，小泡和细管簇源自分泌途径，通常与线粒体相邻。我们发现这些簇簇整体移位到液泡旁，形成吞噬细胞组装位点（PAS），在那里它们成为自噬体前体，吞噬细胞。此外，遗传分析表明，Atg1、Atg13和磷脂酰肌醇-3-磷酸参与了这些初始膜的进一步重排。因此，我们的数据显示，Atg9阳性的隔室对于PAS的从头形成和作为自噬特征的隔离囊泡非常重要。

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图1。
图1。
用于IEM分析的Atg9-GFP构造。（A） 在Atg9-GFP表达细胞中，prApe1处理正常。这个atg9Δ（JCK007）突变株经空载体（pRS416）转化，该质粒携带自动液位计9基因（pJK1-2416）或ATG9-GFP融合（pATG9GFP416）在YPD培养基中生长到对数期，然后通过免疫印迹分析prApe1成熟。细胞溶质蛋白Pgk1用作负荷控制。M（M）第页以千道尔顿表示。黑线表示中间车道已拼接。（B） 在Atg9-GFP存在的情况下，自噬是正常的。这个atg9Δ表达Pho8Δ60并用A中描述的相同质粒转化的（FRY300）细胞从YPD培养基（深灰色条）转移到SD-N培养基（浅灰色条）4 h。通过Pho8活性测定测定自噬诱导。（C和D）Atg9-GFP具有正态分布，其中包含Atg9-GFP的点之一是PAS。表达Atg9-GFP的菌株在自动液位计9启动子（FRY162）或TPI1型用携带PAS蛋白标记RFP-Atg8的质粒（promRFPATG8415）转化启动子（MMY067）。（C） 将转化细胞培养至对数期并成像。计算每个细胞Atg9-GFP点的数量（D），误差条表示平均值的标准偏差。箭头突出显示同位化。（E和F）Atg9-GFP的一部分分布于线粒体。用表达线粒体靶向RFP的pmitoDsRed415质粒转化C中分析的菌株并成像（E）。箭头突出显示线粒体附近的Atg9点。线粒体（F）上Atg9-GFP点分布的测定如材料和方法中所述，误差条表示平均值的标准偏差。驾驶员信息中心（DIC），差分干扰对比度。棒材，2µm。
图2。
图2。
表达Atg9-GFP的野生型细胞的IEM分析。Atg9-GFP（MMY067）细胞生长至对数期，并按照材料和方法中的描述进行IEM处理。A-D中显示的制剂是仅标记GFP的免疫金，而E中显示的是标记GFP和Ape1的双重免疫金。（A） 已标记单元格部分的概述。（B） 插图A显示了小泡和小管的Atg9阳性簇。（C） 线粒体附近含有Atg9的膜状排列（箭头）(≤50 nm距离）。（D） 显微照片显示GFP标记的细胞有两个Atg9簇（用箭头和箭头标记），其中一个（箭头）与直径为100–150 nm的电子致密结构有关（虚线）。（E） 在Atg9团簇附近发现并标记为Ape1的圆形电子致密结构是Cvt复合物（虚线）。虚线池强调Cvt复合体表面与含有Atg9的膜无关。D和E也显示在图S1（A和B）为了清晰起见，没有虚线，而图S1、C–H中显示了Atg9簇的其他示例。每张照片的顶部都标明了金颗粒的大小。CW，细胞壁；M、 线粒体；MVB，多泡体；N、 细胞核；PM，质膜；五、 液泡。棒，200纳米。
图3。
图3。
线粒体蛋白标记物不定位于Atg9簇。（A） 从野生型（MMY067）菌株获得的超薄冰冻切片仅对Por1进行了免疫金标记，因为抗Por1抗体在双重标记中不起作用。虚线突出显示了Atg9集群。对表达Atg9-GFP和线粒体标记物Idh1-3xHA（MOY003）的（B–F）细胞进行IEM处理，冰冻切片用双免疫金标记GFP和HA。CW，细胞壁；M、 线粒体；N、 细胞核；PM，质膜；五、 液泡。棒材，200 nm。
图4。
图4。
Atg9通过部分分泌途径运输。（A） Atg9易位进入内质网。野生型（MMY126）和秒12表达Sec63-mChe-V5并携带pGalATG9GFP416质粒的（MMY129）细胞在24°C的SMD中生长，然后转移到含半乳糖的培养基中。随后分离培养物，并在成像前分别在24°C或37°C下培养2小时。当细胞在葡萄糖存在下生长时，未检测到荧光信号（未描述）。（B） Atg9在到达最终目的地之前经过高尔基。野生型（MMY125）和第7秒表达基因组mChe-V5标记的Sec7和Sec7的（MMY127）细胞时间分别用pGalATG9GFP416质粒转化进行分析，如图A所示。箭头强调了Atg9-GFP和Sec7之间的共定位ts秒-mChe输入第7秒ts秒37°C下的电池。驾驶员信息中心（DIC），差分干扰对比度。棒材，2µm。
图5。
图5。
Atg9浓缩成一种新的细胞器。（A） Atg9-GFP在胞吞作用后不久与一些FM 4-64阳性斑点共定位。按照材料和方法中的描述，将基因组表达GFP标记的Tlg1（FRY360）或Atg9（FRY162）的菌株生长到对数期，然后暴露于FM 4-64。箭头突出显示FM 4-64和GFP-Tlg1或Atg9-GFP之间的协同定位。（B） Atg9不与内胚体和高尔基体蛋白标记物共定位。在固定和成像之前，将Atg9-GFP Vrg4-mChe-V5（FRY340）、Atg9-GFP Sec7-dsRED（FRY341）、GFP-Tlg1 Atg9-mChe-V4（FRY34.2）和GFP-Pep12 Atg9-m Che-V5菌株生长到对数相。棒材，2µm。（C） 如材料和方法所述，对B中显示的共定位实验进行了统计评估。Atg23被用作共定位的阳性对照，因为它与Atg9形成复合物（Reggiori等人，2004a）。驾驶员信息中心（DIC），差分干扰对比度。
图6。
图6。
Atg9-GFP分布自动变速箱突变体。这个atg11Δ（MMY069；A和B），atg1Δ（MMY068；C和D），atg13Δ（MMY070；E和F），以及atg14Δ（MMY071；G和H）菌株的生长和处理如图2所示。冷冻切片单独（A、B和D–J）或与Ape1（C）联合进行GFP免疫标记。（A和B）观察到的Atg9水库atg11Δ细胞。（C和D）PAS在atg1Δ淘汰赛。（E和F）PAS存在于在13Δ该菌株表现出由许多小泡包围的Cvt复合物。（G和H）管式膜在PAS的富集atg14Δ突变体。Cvt复合体用虚线突出显示。D–F也显示在图S4（E、F、I和J）图S4（A–D、G、H和K–Q）中给出了其他示例，但为了清晰起见，没有虚线。CW，细胞壁；M、 线粒体；N、 细胞核；PM，质膜；五、 液泡。棒材，200 nm。
图7。
图7。
野生型Atg9簇的亚细胞分离，atg11Δ、和atg1Δ背景。（A） Atg9-PA（172法国法郎），Atg9-PAatg11Δpep4Δ（FRY250）和附件9-PAatg1Δpep4Δ（FRY196）菌株生长到对数期，转化为球形体，并进行裂解，然后在13000℃离心细胞提取物克然后用SDS-PAGE分离细胞提取物（T）、上清液（S13）和颗粒（P13）组分，并用抗PA抗体通过Western blotting分析Atg9分布。通过验证细胞溶质Pgk1和线粒体Por1的分配来评估有效的裂解和正确的分离。M（M）第页以千道尔顿表示。（B） S13上清液在蔗糖分级密度梯度上进行分级，并使用针对PA（Atg9-PA）、Pep12、Tlg1和Pgk1的抗血清进行Western blotting分析。（C） 免疫印迹定量。
图8。
图8。
Atg9水库整体移动成为PAS。这个ape1Δatg1Δ（MMY078）双突变体在氮饥饿诱导自噬之前生长到对数期。在0、10、20、30、45和60分钟后收集等分细胞，然后进行IEM处理，冰冻切片用免疫金标记GFP（A-C）。（A） 在0分钟时间点观察到的线粒体附近的Atg9水库。（B和C）饥饿60分钟后检测到靠近液泡限制膜的Atg9簇。每张图片的顶部显示了金颗粒的大小。M、 线粒体；五、 液泡。棒材，200 nm。（D） Atg9-GFP簇的相对亚细胞分布ape1Δatg1Δ诱导自噬60分钟前后的细胞。按照材料和方法进行统计分析。（E） 细胞质中分离的Atg9阳性囊泡的数量在触发Atg9在ape1Δatg1Δ通过自噬诱导突变。随机选择100个细胞图谱，确定每个细胞图谱中分离出的Atg9阳性小泡的数量。D和E中的结果以百分比±平均值的标准误差（误差条）表示。
图9。
图9。
Atg9储层的活细胞成像成为PAS。将Atg9-mChe-GFP-Atg8（MMY120）细胞培养至对数期，转移至SD-N培养基中20分钟，然后按照材料和方法中的描述进行成像。显示了以5s的时间间隔采集的序列图像。箭头突出显示了在成为PAS的过程中最终与Atg8共定位的Atg9水库。完整的电影重建如所示视频1表达内源性Atg9-GFP（FRY172）并携带表达mChe-Atg8的pCumCheV5ATG8415质粒的细胞获得了相同的结果(视频2). 驾驶员信息中心（DIC），差分干扰对比度。棒材，2µm。
图10。
图10。
Atg9水库在双膜囊泡形成中的作用模型。Atg9贮存器通常与线粒体相邻，起着前PAS的作用。在营养丰富的条件下与prApe1低聚物相关（Cvt途径），可能在饥饿（自噬）期间与细胞信号相关，导致一个或多个Atg9贮存器的易位与液泡接近。这种重定位事件触发了Atg蛋白其余部分的募集到一个储存库中，导致PAS的形成。构成PAS的小管泡膜的连续融合以及可能从其他Atg9贮存器和/或其他来源获得的额外膜产生了一个双膜泡。
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