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。2010年10月8日；40(1):159-71.
doi:10.1016/j.molcel.2010.08.038。 Epub 2010年9月16日。

伴侣级联对翻译后膜插入内质网的蛋白质进行分类

王飞（音译） 1, 艾米丽·布朗, 麦嘉礼（Gary Mak）, 吉米·庄, 弗拉基米尔·丹尼克
附属公司

伴侣级联对翻译后膜插入内质网的蛋白质进行分类

王飞（音译）等。 分子电池。 。

摘要

尾锚定（TA）蛋白翻译后插入内质网（ER）或线粒体外膜。TA蛋白的C末端跨膜结构域（TMD）通过指定膜靶点来实现其许多重要的细胞功能，但细胞如何处理这些靶向信号尚不清楚。在这里，我们揭示了一个保守的多蛋白TMD识别复合物（TRC）的组成，并表明不同的TRC亚基识别这两种类型的TMD信号。通过对线粒体TMD进行基因工程突变，我们转换了其TRC亚基识别，从而导致其错误插入内质网。用纯化成分进行生化重建表明，TRC系链和酶激活Get3，选择性地将与内质网结合的TA蛋白传递给Get3。因此，ER结合的TA蛋白在TMD伴侣级联的顶部被分选，TMD伴侣级联最终形成Get3-TA蛋白复合物，该复合物被募集到ER膜中进行插入。

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数字

图1
图1。Get4和Get5护送TA蛋白质到Get3
（A） 缺乏跨膜结构域（Sec22Delta；TMD）的Sec22或Sec22的体外翻译（IVT）35S-标记蛋氨酸GET3公司或获取3FLAG提取物。如随附示意图所示，在进行抗FLAG免疫沉淀（IP）和3×FLAG肽洗脱后，用SDS-PAGE分离3%的总（T）和30%的洗脱（E），并用放射自显影术进行分析。所有数字中的虚线表示数据来自同一凝胶。（B和C）在指示提取物中对Sec22进行体外翻译（IVT），然后进行抗FLAG免疫沉淀（IP）和3×FLAG肽洗脱。样品通过放射自显影和免疫印迹（IB）进行制备和分析，如（A）所示。（D） Sec22的体外翻译（IVT）获取4FLAGΔ获取3提取物随后进行抗FLAG免疫沉淀（IP），并在室温或模拟处理下用重组Get3（0.4μg/μl）洗脱20分钟，如随附示意图所示。离心后，用SDS-PAGE对洗脱物进行分离，并用放射自显影术进行分析。洗脱效率定义为通过Get3洗脱的固定化Sec22输入（通过SDS-PAGE加载缓冲液洗脱确定）的百分比。（E） 分离（D）中的Get3洗脱物并与野生型（WT）或Δ获得1/2微粒体在室温下30分钟或模拟处理。样品通过SDS-PAGE进行解析，并通过放射自显影进行分析。显示Sec22和糖基化Sec22（gSec22）的位置。Sec22包含一个带有N-聚糖受体位点的C-末端Opsin标签，有助于检测正确插入的Sec22，如随附示意图所示。插入效率定义为糖化Sec22总量的百分比。请注意，一些Sec22可能被正确插入，但未被糖基化。
图2
图2。Sgt2是一种结合Get4/5、热休克蛋白和TA蛋白的支架蛋白
（A） 用抗FLAG树脂免疫沉淀（IP）所示FLAG标记菌株的细胞质裂解物。洗涤后，用3×FLAG肽洗脱树脂。洗脱的蛋白质通过SDS-PAGE进行解析，并通过考马斯蓝染色进行可视化。通过质谱分析确定蛋白质身份（图S2A）。请注意，来自Δ获得4由于部分蛋白水解，很难看到制备过程（图S2B）。（B） 显示亲和纯化的Get4/5FLAG细胞溶质复合物的亚单位组织的示意图。Ybr137w的C末端尾部存在多个酸性残基，这表明它与Hsp104和Hsp70一样，直接与Sgt2的TPR结构域相互作用。原理图并非用于指定复合体中每个零部件的副本编号。（C和D）在所示提取物中的Sec22或Sec22ΔTMD的体外翻译（IVT）后，进行抗FLAG免疫沉淀（IP）和3×FLAG肽洗脱。样品通过放射自显影和免疫印迹（IB）进行制备和分析，如图1所示。（E） 用抗FLAG树脂免疫沉淀（IP）所示FLAG标记菌株的细胞质裂解物。洗涤后，用3×FLAG肽洗脱树脂。洗脱的蛋白质通过SDS-PAGE进行解析，并通过考马斯蓝染色进行可视化。通过质谱分析确定蛋白质身份。*表示源自Sgt2的蛋白质片段的位置。
图3
图3。Sgt2富含蛋氨酸的C末端结构域与TA蛋白的疏水跨膜结构域结合
（A） Sgt2的三个蛋白质结构域示意图。括号内的区域表示所示第2级截短的跨度。下面显示的是来自酿酒酵母（NP_014649.1），智人（NP_003012.1），秀丽隐杆线虫（NP_494893.1），以及黑腹果蝇（NP_609842.1）。ESScript 2.0用于突出显示相同（白色，用红色框住）、保守（红色，用白色框住）和蛋氨酸残留（蓝色阴影）。请注意酿酒酵母Sgt2（残基208至346）为7.2%，而其他三个Sgt2 C-末端结构域的平均值为7.7%。SRP同源物的M结构域中蛋氨酸的平均百分比（参见Keenan等人，1998年的图5）为2.3%。（B） Sec22在指示提取物中的体外翻译（IVT），然后进行抗FLAG免疫沉淀（IP）和3×FLAG肽洗脱。10%的IP输入（T）和20%的3×FLAG肽洗脱（E）通过SDS-PAGE进行解析，并通过放射自显影和免疫印迹（IB）进行分析。（C） 所示的细胞溶胶裂解物（T）大肠杆菌菌株用Ni-NTA树脂免疫沉淀（IP）。清洗后，用咪唑（E）洗脱树脂。洗脱的蛋白质通过SDS-PAGE进行解析，并通过免疫印迹（IB）进行可视化，如图所示。
图4
图4。中士2选择性识别分泌途径中TA蛋白的靶向决定因素
（A） 在WT提取物中Fis1或（4L）Fis1的体外翻译（IVT）后，用WT或Δ获得1/2微粒体在室温下放置30分钟。使用带有N-聚糖受体位点的C-末端Opsin标签监测插入（见图1E）。样品通过SDS-PAGE进行解析，并通过放射自显影术进行分析（显示为典型分析）。显示了Fis1/（4L）Fis1和糖基化Fis1/。图示为插入的Fis1和（4L）Fis1百分比的平均值和标准偏差（三个独立实验）。同样以红色突出显示的是（4L）Fis1跨膜结构域（TMD）序列中的四个亮氨酸取代。（B） 所示TA蛋白在体外转化为可比的最终浓度SGT2FLAGΔ获取3/5提取（数据未显示）。在抗FLAG免疫沉淀和3×FLAG肽洗脱后，用SDS-PAGE解析总（T）和洗脱（E）样品，并用放射自显影法（显示为典型分析）和抗FLAG的免疫印迹法（数据未显示）进行分析。图中显示了每个TA蛋白与Sgt2共免疫沉淀（coIP）效率的平均值和标准偏差（三个独立实验）。（C和D）在指示提取物中指示TA蛋白的体外翻译（IVT）后，进行抗FLAG免疫沉淀（IP）和3×FLAG肽洗脱。样品通过放射自显影和免疫印迹（IB）进行制备和分析，如图1所示。
图5
图5。从Sgt2到Get3的TA蛋白交接物的体外重组
（A） Sec22的体外翻译（IVT）SGT2FLAGΔ获取3/5提取液，然后进行抗FLAG免疫沉淀（IP）和3×FLAG肽洗脱。分离洗脱液，并在室温下用Get蛋白（Get3为35 ng/μl，Get4-Get5为70 ng/μl）或模拟处理培养20 min。然后在室温下用GET1/2号机组或Δ获得1/2微粒体，如图所示。为了最大限度地减少胞质Sgt2、Get3和Get5对微粒体的任何潜在污染，获得1/2微粒体是由Δsgt2&；增量获得3/5应变。显示Sec22和糖基化Sec22（gSec22）的位置（见图1E）。（B） Sec22的体外翻译（IVT）SGT2FLAGΔ获取3/5提取后进行抗FLAG免疫沉淀（IP），并在室温或模拟处理下用指示的Get蛋白洗脱20分钟（均为64 ng/μl），如随附示意图所示。离心后，收集洗脱液，清洗树脂，然后再次洗脱，但这一次使用凝胶负载缓冲液（洗脱后的树脂）。洗脱物通过SDS-PAGE进行解析，并通过放射自显影术进行分析。这些数据分别在左侧和右侧框中，表示它们来自不同日期进行的实验。（C和D）所示TA蛋白的体外翻译（IVT）SGT2FLAGΔ获取3/5提取液随后进行抗FLAG免疫沉淀（IP），并在室温下用指示的Get蛋白洗脱20分钟。样品的制备和分析采用放射自显影法，如（B）所示。
图6
图6。Get4和Get5通过双重机制促进TA蛋白切换
（A） Sec22的体外翻译（IVT）SGT2FLAGΔ获取3/5提取液随后进行抗FLAG免疫沉淀（IP），并在室温下以不同浓度的Get3在有或无Get4-Get5的情况下洗脱20分钟。所示为不同Get3浓度（从8 ng/μl开始）下洗脱的Sec22百分比的平均值和标准偏差（两个独立实验）。注意，轴断裂后的Get3浓度数据未用于曲线拟合，模拟处理后的背景洗脱率约为4%。单独的双曲线拟合（包括所有Get3浓度下的背景洗脱和洗脱数据；见实验程序）得出的Get3半最大浓度为0.23μg/μl（不含Get4/5）和0.0092μg/微升（含Get4/5）。（B） 如附图所示，用Get3FLAG或空树脂预固定的抗-FLAG树脂与所示重组蛋白孵育并用3×FLAG肽洗脱。输入（I）和洗脱（E）通过SDS-PAGE进行解析，并通过SYPRO Ruby染色进行可视化。（C） Sec22的体外翻译（IVT）SGT2FLAGΔ获取3/5提取液随后进行抗FLAG免疫沉淀（IP），并在Get3和预成型Get4-Get5复合物存在下以不同浓度的游离Get5洗脱。样品的制备和分析如图5B所示。所示为不同浓度的游离Get5洗脱的Sec22百分比的平均值和标准偏差（两个独立实验）。图中还显示了在存在过量Get5的情况下，第二军士和第三军士分离为单独的复合体的示意图。（D） Sec22的体外翻译（IVT）SGT2FLAGΔ获取3/5提取液随后进行抗FLAG免疫沉淀（IP），并用指示的Get蛋白洗脱。值得注意的是，在4°C下进行洗脱，以减缓洗脱动力学（数据未显示），并留出足够的时间进行样品处理。样品的制备和分析如图5B所示。显示了在向树脂固定的Sgt2中添加Get蛋白后，在不同时间洗脱的Sec22百分比的平均值和标准偏差（两个独立实验）。请注意，曲线拟合中未使用轴打断后时间点的数据。
图7
图7。用于TA蛋白分类的TMD伴侣级联模型
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