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.2011年10月；16(10):1006-23.
doi:10.1038/mp.2010.87。 Epub 2010年9月14日。

精神疾病危险因素DISC1和TNIK相互作用调节突触组成和功能

Q王 1, E I沙里赫, V L普利托, J·B·李, N M格拉齐安, R A克罗泽, R雷维拉·桑奇, M P Kelly女士, A J邓洛普, H默多克, N泰勒, Y Xie（Y谢）, M Pausch先生, 一个Hayashi-Takagi, K石冢, 塞沙德里, B贝茨, K卡里亚, A Sawa公司, R J温伯格, S J莫斯, M D Houslay先生, Z严, N J布兰登
附属公司

精神疾病危险因素DISC1和TNIK相互作用调节突触组成和功能

Q王等。 摩尔精神病学. 2011年10月.

摘要

精神分裂症1型（DISC1）是包括精神分裂症、双相情感障碍和自闭症在内的多种严重精神疾病的遗传风险因素，是与正常发育和疾病过程相关的多种神经元功能的关键调节器。由于这些疾病被认为在突触功能和结构方面存在共同缺陷，我们使用一种侧重于了解DISC1特别是在突触处的蛋白-蛋白质相互作用的方法分析了DISC1的作用。我们确定Traf2和Nck相互作用激酶（TNIK）是DISC1的关键突触伙伴，它本身是一种新出现的疾病风险因素，并提供证据证明DISC1-TNIK相互作用通过稳定关键突触后密度蛋白的水平来调节突触组成和活动。了解新型DISC1-TNIK相互作用可能有助于深入了解主要精神疾病的病因和潜在的突触缺陷。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1
DISC1上的13个氨基酸区域需要与TNIK相互作用。(一)TNIK与N末端激酶结构域（KD）和C末端柠檬酸同源结构域（CNH）的示意图。点突变体K54R是一种激酶缺失突变体。(b条)DISC1与TNIK的激酶结构域结合。Myc-DISC1与HA-TNIK WT共同免疫沉淀，但与HEK293细胞的HA-TNIKΔKD无关。(c（c）)TNIK结合位点内DISC1和点突变体的示意图。DISC1ΔTNIK中删除了氨基酸329–350。DISC1 AS1–6是丙氨酸取代（AS）突变体，其下划线的氨基酸残基突变为丙氨酸。(d日)氨基酸对DISC1和TNIK的相互作用至关重要。Myc-DISC1 WT，但不是Myc-DISC1 DTNIK，与HEK293细胞的HA-TNIK共同免疫沉淀。
图2
图2
DISC1与大脑中的TNIK相关。(一)原位杂交显示TNIK和DISC1 mRNA在成年小鼠脑中的表达。(b条)成年小鼠的CA1单平面共焦图像，免疫染色DISC1（绿色）、TNIK（红色）和神经元标记NeuN（蓝色），显示DISC1和TNIK在可能的树突投射中的共定位。(c（c）)19–26 DIV大鼠原代海马培养物的单平面共焦图像显示TNIK与神经元和PSD标记物以及DISC1共定位，但与胶质标记物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）没有共定位。(d日)电子显微照片，包埋前免疫金染色，显示成年大鼠CA1树突棘中存在TNIK和DISC1。(e（电子）)TNIK和DISC1富含大鼠海马的PSD部分。脑匀浆；ERGO、ER和高尔基体；P1，细胞核和未破裂细胞；P2，细胞器；PSD1-3，PSD分数1-3；S1，细胞质；SarS，肌氨酰可溶部分；TxS1和2，Triton X-100可溶性组分1和2。(（f）)大鼠脑TNIK和DISC1的共免疫沉淀。使用DISC1-440（左）和TNIK Santa Cruz（右）抗体进行IP，然后使用这两种抗体进行免疫印迹（WB）。
图3
图3
DISC1抑制TNIK激酶活性依赖性细胞输出。(一)TNIK诱导的激酶依赖性细胞圆形化。将HA-TNIK WT、K54R或Myc-DISC1 WT单独转染NIH3T3细胞，然后用抗HA或抗Myc抗体进行免疫荧光染色。(b条)DISC1抑制TNIK诱导的细胞圆形化。用HA-TNIK WT和Myc-DISC1 WT联合转染NIH3T3细胞，然后用抗HA和抗Myc抗体进行免疫荧光染色。(c（c）)DISC1上的TNIK结合位点是抑制TNIK诱导的细胞圆整所必需的。对联合转染和HA-TNIK染色的细胞代表性图像以及细胞的长宽比进行了分析(d日)作为细胞扩散的替代措施。N个>30. *P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001.
图4
图4
结合位点衍生的DISC1肽抑制TNIK激酶活性。(一)DISC1肽序列与Tat的膜转导结构域融合。DISCpep-WT含有人类DISC1的329–349氨基酸，DISCpep-PM有三个被丙氨酸取代的残基。小鼠/大鼠版本的DISCpep-WT在小鼠DISC1中含有330–350氨基酸，并且在小鼠和大鼠中完全相同。(b条)DISCpep-WT抑制TNIK激酶活性体外使用MBP作为底物，使用0.15µM纯化的人TNIK和10µM多肽进行激酶反应，无论是否进行TNIK预自动磷酸化步骤。(c（c）)DISC1肽效应总结。每个反应中的MBP磷酸化被归一化为与Tat肽的反应，但没有预自磷酸化（第2条通道）。(d日)DISCpep-WT抑制内源性TNIK的激酶活性。使用MBP作为底物，利用HEK293细胞或22 DIV大鼠海马培养物（顶部）和10µM指示肽的内源性TNIK免疫沉淀进行激酶反应。每个反应的激酶输入通过使用抗TNIK抗体的western blotting显示（中间），MBP输入通过考马斯蓝染色显示（底部）。(e（电子）)DISCpep-WT对内源性TNIK的影响概述。每个反应中的MBP磷酸化被归一化为与来自HEK293细胞的Tat肽和TNIK的反应。N个=3. *P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001.
图5
图5
DISC1衍生肽抑制原代海马神经元中的TNIK并调节PSD蛋白水平。(一)DISCpep-WT导致总TNIK和磷酸化TNIK水平降低。用10µM的指定肽处理初级海马神经元（16–22 DIV）40分钟。N个= 3. (b条)DISCpep-WT增加了丝状体-球状体（F/G）-肌动蛋白比率。文化被视为(一)然后进行Triton X-100萃取，以分离Triton可溶性（TxS）和Triton不溶性（TxIS）馏分。TxS和TxIS分别含有G-和F-actin。N个= 3. (c（c）)DISCpep-WT导致关键PSD蛋白的总水平降低。肽治疗与(一)除指示蛋白外，其他蛋白均进行了分析。N个=3.总蛋白归一化为β-肌动蛋白，磷酸化蛋白为相应的总蛋白*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001.
图6
图6
TNIK抑制后PSD95和GluR1的丢失是通过蛋白酶体和溶酶体降解途径实现的。(一)蛋白酶体抑制剂MG132和溶酶体抑制剂leupeptin分别挽救了PSD-95和GluR1的降解。用10µM MG132或25µgml预处理初级海马神经元（16–22 DIV）−1在用10µM所示肽处理40分钟之前，将leupeptin持续7小时。(b条)MG132和leupeptin的作用总结。N个=4.将总蛋白标准化为β-肌动蛋白，并将磷酸化蛋白标准化为相应的总蛋白*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001.
图7
图7
TNIK的抑制导致GluR1和AMPAR mEPSCs的表面水平降低。(一)初级海马神经元（19–22 DIV）树突段的代表性图像，用10µM的指定肽处理30分钟，然后对表面GluR1和PSD-95进行免疫染色。(b条)DISCpep-WT处理降低了表面GluR1和PSD-95点的大小、密度和强度。N个= 15. (c（c）)DISCpep-WT治疗降低了用指定肽预处理40分钟的初级海马神经元（13或19 DIV）的mEPSC振幅和频率。代表性痕迹显示在右侧。N个≥4. *P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001.
图8
图8
DISC1和TNIK以复杂的方式调节PSD的组件。(a、 b条)慢病毒表达的shRNA敲除TNIK可调节原代海马培养物中PSD蛋白的水平，与肽抑制介导的效应一致。N个=4. (c、 d日)TNIK shRNA敲除导致GluR1总量和表面的减少。N个=5. (e（电子）)TNIK shRNA敲除导致初级海马神经元中mEPSC振幅降低，但频率没有降低，这种降低可以通过抗敲除TNIK而不是WT TNIK来挽救。代表性痕迹显示在右侧。N个≥4. (（f）)DISC1敲除调节原代海马培养物中PSD蛋白的水平。N个=3.总蛋白归一化为β-肌动蛋白，磷酸化蛋白为相应的总蛋白*P（P）<0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001.
图8
图8
DISC1和TNIK以复杂的方式调节PSD的组件。(a、 b条)慢病毒表达的shRNA敲除TNIK可调节原代海马培养物中PSD蛋白的水平，与肽抑制介导的效应一致。N个=4. (c、 d日)TNIK shRNA敲除导致GluR1总量和表面的减少。N个=5. (e（电子）)TNIK shRNA敲除导致初级海马神经元中mEPSC振幅降低，但频率没有降低，这种降低可以通过抗敲除TNIK而不是WT TNIK来挽救。代表性痕迹显示在右侧。N个≥4. (（f）)DISC1敲除调节原代海马培养物中PSD蛋白的水平。N个=3.将总蛋白标准化为β-肌动蛋白，并将磷酸化蛋白标准化为相应的总蛋白*P（P）<0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001.
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