跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https公司

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2010年9月6日；190(5):881-92.
doi:10.1083/jcb.200911078。

内源性HMGB1调节自噬

道林堂 1, 瑞康, 克里斯汀·利弗西, Chun-Wei Cheh先生, 亚当·法卡斯, 帕特里夏·洛夫兰, 乔治·霍普, 马可·比安奇, 凯文·J·特蕾西, 赫伯特·J·泽三世, 迈克尔·T·洛兹
附属机构

内源性HMGB1调节自噬

道林堂等。 J细胞生物学. .

摘要

自噬清除长寿蛋白质和功能失调的细胞器，并在饥饿和其他类型的细胞应激期间生成生成三磷酸腺苷的底物。在这里，我们表明高迁移率族框1（HMGB1），一种染色质相关核蛋白和细胞外损伤相关分子模式分子，是自噬的关键调节器。增强活性氧物种的刺激物促进HMGB1的胞质易位，从而增强自噬通量。HMGB1直接与取代Bcl-2的自噬蛋白Beclin1相互作用。HMGB1的半胱氨酸106（C106）的突变，而不是邻近的C23和C45的突变，促进了胞浆定位和持续的自噬。丙酮酸乙酯等药剂对HMGB1细胞质易位的药理学抑制限制了饥饿诱导的自噬。此外，HMGB1的分子内二硫键（C23/45）是与Beclin1结合并维持自噬所必需的。因此，内源性HMGB1是一种关键的自噬前蛋白，可提高细胞存活率并限制程序性凋亡细胞死亡。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
自噬促进核外HMGB1易位，并依赖ROS生成。（A） HMGB1在自噬过程中从细胞核转运到胞浆，但不发生凋亡。用1µM雷帕霉素（Rap）处理小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）和人Panc2.03肿瘤细胞系12 h，饥饿（HBSS）处理3 h，或用50 mJ/cm的紫外线照射2在12小时恢复前5分钟，然后用HMGB1特异性抗体（绿色）和Hoechst 33342（蓝色）进行免疫染色。每个细胞的平均核（Nuc）和细胞溶质（Cyt）HMGB1强度通过成像细胞术分析测定，如材料和方法中所述。*，与未经治疗（UT）组相比，P<0.05和**，P<0.005；n个= 3. 代表性图像如图所示（右）。（B） 自噬抑制阻断HMGB1易位。用100 nM沃特曼或10µM Ly294002预处理细胞1 h或ATG5特异性shRNA预处理细胞48 h，用饥饿（HBSS）刺激细胞3 h，并用HMGB1-或LC3-特异性抗体和Hoechst 33342进行免疫染色。通过成像细胞分析测定核/细胞溶质HMGB1的平均强度和每个细胞的LC3点。shRNA和HMGB1染色后ATG5水平的代表性Western blot如图所示（右）。同时，用GFP-LC3质粒转染所示细胞，并通过量化带有GFP-LC3punctae的细胞百分比来检测自噬，与HBSS组相比，P<0.05，**，P<0.005，***，P<0.0005；n个= 3. 控制，控制。（C） 敲除ATG5抑制LC3-II表达。Western blot分析在B.Actin所述条件下Panc02细胞中LC3-I/II的表达，作为负荷对照。（D） 嗯1−/−不影响ATG5染色。嗯1−/−和Hmgb1+/+MEF用HMGB1特异性抗体（绿色）、ATG-5特异抗体（红色）和Hoechst 33342（深蓝色）进行免疫染色。右侧面板中描述了具有代表性的图像。（E） mETC抑制剂促进ROS生成、自噬和HMGB1易位。以指定剂量用鱼藤酮（Rot）、三氟丙酮（TTFA）和抗霉素A（AA）刺激Panc2.03细胞12 h，并通过在荧光板阅读器中测量CM-H2DCFDA的荧光强度来评估ROS生成。在平行实验中，用HMGB1或LC3特异性抗体和Hoechst 33342对细胞进行免疫染色。通过成像细胞术分析测定每个细胞的平均核/胞浆HMGB1强度和LC3点状。*，与未治疗组相比，P<0.05，**，P<0.005，***，P<0.0005；n个= 3. （F） mETC抑制剂增加LC3-II表达并促进HMGB1易位。如E.中所示，LC3-I/II和核/细胞溶质HMGB1表达的Western blot分析是核组分控制，微管蛋白是细胞质组分控制。（G） 抗氧化剂和SOD RNAi限制饥饿诱导的自噬和HMGB1易位。用指定浓度的抗氧化剂（NAC）预处理Panc2.03细胞1小时，或用SOD1或SOD2 siRNA预处理48小时。然后将细胞饥饿（HBSS）3小时，并通过成像细胞术进行分析，以确定平均核/细胞溶质HMGB1强度和每个细胞的LC3点。*，P<0.05；**，P<0.005；***，与HBSS组相比，P<0.0005；n个= 3. 本文描述了siRNA后SOD1和SOD2水平的代表性蛋白质印迹。（H） 抗氧化剂和SOD RNAi通过LC3-II表达来限制饥饿诱导的自噬。Western blot分析LC3-I/II在G.肌动蛋白所示条件下的表达作为负荷对照。数据为平均值±SEM。
图2。
图2。
HMGB1的耗尽抑制自噬。（A） HMGB1基因敲除抑制LC3突起的形成。HMGB1标准−/−和HMGB1+/+如图所示，用自噬刺激处理MEF，并用LC3抗体或GFP-LC3检测LC3穿孔形成，如材料和方法所述。*，P<0.05；**，P<0.005；和***，P<0.0005与Hmgb1+/+组；n个= 3. UT，未经处理。（B） Hmgb1中LC3穿孔的代表图像−/−和HMGB1+/+描述了具有指定处理的MEF。A中报告了显示LC3点蓄积的细胞百分比。（C）在有或无溶酶体蛋白酶抑制剂胃蛋白酶抑制素A（pepA）和E64D（10µg/ml）的情况下，饥饿处理3小时后，通过自噬分析LC3处理。**，与Hmgb1相比，P<0.05+/+组；n个= 3. 肌动蛋白被用作加载控制。AU，任意单位。（D） HMGB1蛋白表达上调可恢复饥饿诱导的自噬。嗯1−/−用HMGB1质粒或空载体转染MEF，然后饥饿处理3 h。通过成像细胞术分析检测LC3点形成。**，与载体组相比P<0.05；n个= 3. 无，未转染。（E） 饥饿处理3小时后，在溶酶体蛋白酶抑制剂胃蛋白酶抑制素A（10µg/ml）和E64D（10μg/ml）存在或不存在的情况下，通过自噬分析p62处理**，P<0.005和***，P<0.0005与Hmgb1+/+组；n个= 3. 代表性图像如图所示（左图）。（F） Hmgb1的超微结构特征−/−和Hmgb1+/+有或无饥饿（HBSS 3小时）治疗的MEF（a–e指自噬体和自溶体）。数据为平均值±SEM。
图3。
图3。
细胞质HMGB1对自噬的抑制作用。嗯1−/−和Hmgb1+/+如材料和方法中所述，细胞松弛素B处理后，通过离心法将MEF剜除，然后用HBSS处理3h，并用共焦显微镜检测LC3点形成。（A） HMGB1细胞质中LC3点（白色箭头）和HMGB1（红色箭头）的代表性图像−/−和Hmgb1+/+描述了MEF。（B） 报告显示LC3点状细胞积聚的细胞百分比（*，P<0.05；n个= 3). 数据为平均值±SEM。
图4。
图4。
HMGB1的缺失维持了Beclin1–Bcl-2的相互作用。（A） MEK抑制剂阻断饥饿诱导的p-ERK和Bcl-2。HMGB1标准−/−和HMGB1+/+在存在或不存在10µM U0126和20µM PD98059的情况下，将MEF饥饿6小时。通过co-IP或Western blotting评估蛋白质表达水平。（B） HMGB1基因敲除限制了自噬刺激治疗期间Bcl-2–Beclin1复合物的分离。HMGB1标准−/−和HMGB1+/+将MEF在有或无10µM U0126的条件下饥饿3 h。然后按照co-IP或Western blotting的指示分析蛋白质表达水平。（C） HMGB1在自噬过程中与Beclin1直接相互作用。用HBSS处理HCT116和Panc02细胞3 h，然后通过co-IP或Western blotting检测蛋白表达水平。（D） HMGB1与Bcl-2的直接相互作用依赖于Beclin1。在HMGB1野生型MEF中通过siRNA敲除Beclin1和Bcl-2，然后通过co-IP或Western blotting检测蛋白表达水平。控制，控制。（E和F）定量数据，证明HMGB1–Beclin1和Beclin1-HMGB1之间的相互作用，使用密度测定软件分析co-IP实验中的相对蛋白质带强度，如A–D所示**，P<0.005和***，P<0.0005；n个= 3. UT，未经处理。数据为平均值±SEM。
图5。
图5。
HMGB1的氧化调节HMGB1亚细胞定位和自噬。（A） HMGB1的C106突变（C106S）损害其核定位。嗯1−/−用指示的野生型和半胱氨酸突变HMGB1-GFP质粒转染MEF，然后用1µM雷帕霉素处理12 h或饥饿处理（HBSS）3 h。通过成像细胞术分析每个细胞的平均核（Nuc）和细胞溶质（Cyt）HMGB1强度。*，与HMGB1相比P<0.05+/+组；n个= 3. HMGB1位置的代表性图像显示在左侧（绿色，HMGB1；蓝色，细胞核）。右侧面板是HMGB1结构的示意图，说明了基本a盒和B盒以及酸性C末端结构域，并确定了半胱氨酸突变位置。（B和C）细胞质HMGB1增强自噬并限制凋亡。HMGB1标准−/−将野生型或半胱氨酸突变型HMGB1-GFP质粒转染MEF，然后在指定时间内饥饿（HBSS）。在一个平行实验中，Hmgb1+/+MEF用5 mM丙酮酸乙酯（EP）预处理2 h，然后按指示饥饿。如材料和方法中所述，通过成像细胞分析（B）检测LC3点形成，并通过FACS（C）检测凋亡。*，P<0.05和**，P<0.005；n个= 3. UT，未经处理。非，非转染。（D） C23/C45是HMGB1与Beclin1结合所必需的。嗯1−/−如图所示，用野生型或半胱氨酸突变体HMGB1-GFP质粒转染MEFs，并用饥饿（HBSS）刺激3小时。然后通过IP或Western印迹测定这些细胞的蛋白质表达水平。印迹是三个具有类似结果的独立实验的代表。（E） 还原试剂破坏了野生型/C106 HMGB1和Beclin1之间的相互作用。作为对照，在IP之前，用50 mM DTT（+DTT）培养样本，并通过IP或Western blotting检测蛋白质表达水平。印迹是两个具有类似结果的独立实验的代表。（F） siRNA对Beclin1的敲除在HMGB1从细胞核转移到胞浆的条件下抑制自噬。用HBSS、雷帕霉素（Rap）、鱼藤酮（Rot）或亚甲酰三氟丙酮（TTFA）刺激细胞3小时或12小时，并按指示分析LC3点形成。**，与Beclin1 shRNA组相比P<0.005；n个= 3. 控制，控制。数据为平均值±SEM。
图6。
图6。
HMGB1介导的自噬需要Beclin1。（A和B）shRNA敲低MEF中的Beclin1抑制外源HMGB1诱导的自噬。用1µg/ml HMGB1蛋白（rHMGB1）刺激所示细胞24 h，并通过Western blotting（A）检测LC3的表达。免疫荧光法（B；n个= 3; *, P<0.05）。（C和D）通过shRNA敲低MEF中的Beclin1抑制HBSS诱导的自噬，无论是否转染pUNO1-HMGB1。用厄尔平衡盐溶液刺激所示细胞3小时，并用Western blotting（C）检测LC3的表达。免疫荧光法（D；n个= 3; *, P<0.05）。数据为平均值±SEM。
图7。
图7。
HMGB1或C106S突变体的表达，而不是C23S和C45S突变体，恢复HMGB1中的自噬通量−/−MEF公司。（A） HMGB1标准−/−用显示的野生型（WT）或半胱氨酸突变HMGB1-GFP质粒转染MEF，在存在或不存在100 nM巴非霉素A1的情况下饥饿（HBSS）3小时，然后用LAMP2特异性抗体/Alexa-Fluor 594二级抗体（红色显示）、LC3-特异性抗体/Alexa-Fluro 647二级抗体进行免疫染色（绿色显示）和Hoechst 33342（以蓝色显示）。在每种条件下，从随机选择的10-15个字段中采集数字图像。（B） 通过Image-Pro Plus 5.1软件检测LAMP2/LC3共定位百分比的定量分析。数据为平均值±SEM。
图8。
图8。
内源性HMGB1和自噬之间的概念关系。在饥饿介导的自噬过程中，ROS触发HMGB1易位到胞浆。然后，细胞溶胶HMGB1结合Beclin1，后者需要C23/45。这导致Beclin1–Bcl-2的解离和随后的自噬诱导。HMGB1中的C106突变（C106S）损害其核定位并促进自噬。丙酮酸乙酯（EP）抑制HMGB1易位阻断自噬。此外，HMGB1促进ERK1/2（p-ERK1/2）通路的磷酸化和激活，这是一种重要的自噬依赖性信号通路。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

中的注释

  • 自噬：在HMGB1手中。
    斯金纳·M·。 斯金纳·M·。 Nat Rev Mol细胞生物学。2010年11月；11(11):756-7. doi:10.1038/nrm2994。Epub 2010年10月6日。 Nat Rev Mol细胞生物学。2010 PMID：20924397 没有可用的摘要。

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Anathy V.、Aseif S.W.、Guala A.S.、Havermans M.、Reynaert N.L.、Ho Y.S.、Budd R.C.、Janssen-Heininger Y.M.，2009年。谷胱甘肽氧还蛋白1的半胱氨酸蛋白酶依赖性裂解和Fas的S-谷氨酰化对细胞凋亡的氧化还原扩增。《细胞生物学杂志》。184:241–252 10.1083/jcb.200807019-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Björköy G.、Lamark T.、Brech A.、Outzen H.、Perander M.、Overvatn A.、Stenmark H.、Johansen T.，2005年。p62/SQSTM1形成自噬降解的蛋白聚集体，对亨廷顿蛋白诱导的细胞死亡具有保护作用。《细胞生物学杂志》。171:603–614 10.1083/jcb.200507002-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Goldman R.D.、Pollack R.、Hopkins N.H.，1973年。通过培养中的去核细胞保持正常行为。程序。国家。阿卡德。科学。美国70:750–754 10.1073/pnas.70.3.750-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Hoppe G.、Talcott K.E.、Bhattacharya S.K.、Crabb J.W.、Sears J.E.，2006年。结构染色质蛋白Hmgb1核转运氧化还原控制的分子基础。实验细胞研究312:3526–3538 10.1016/j.yexcr.2006.07.020-内政部-公共医学
    1. Ishihara K.、Tsutsumi K.、Kawane S.、Nakajima M.、Kasaoka T.，2003年。高级糖基化终产物受体（RAGE）通过D域样对接位点直接与ERK结合。FEBS信函。550:107–113 10.1016/S0014-5793（03）00846-9-内政部-公共医学

出版物类型