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.2010年11月至12月；16(11-12):479-90.
doi:10.2119/molmed.2010.00126。 Epub 2010年8月27日。

饮食限制在对乙酰氨基酚肝毒性期间抑制细胞凋亡和HMGB1氧化并促进炎症细胞募集

丹尼尔·詹姆斯·安托万 1, 多米尼克·P·威廉姆斯, 安贾·基帕, 休·拉弗蒂, B凯文·帕克
附属机构

饮食限制在对乙酰氨基酚肝毒性期间抑制细胞凋亡和HMGB1氧化并促进炎症细胞募集

丹尼尔·詹姆斯·安托万等。 分子医学. 2010年11月至12月.

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摘要

对乙酰氨基酚（APAP）过量是急性肝衰竭的主要原因，可作为阐明机制、诱发因素和治疗干预的范例。细胞凋亡和炎症在APAP肝毒性中的作用仍存在争议。我们研究了小鼠禁食24小时是否可以通过消耗基础ATP来抑制APAP诱导的caspase激活和凋亡。我们还研究了在禁食小鼠中，作为免疫激活机制，通过抑制死亡细胞中ATP耗竭释放的高迁移率族蛋白B1（HMGB1）中半胱氨酸依赖性半胱氨酸106的氧化，发挥关键作用。在喂食APAP的小鼠中，坏死是肝细胞死亡的主要形式。然而，通过K18切割、DNA梯状排列和procaspase-3处理也可以观察到细胞凋亡。在用APAP治疗的禁食小鼠中，只观察到坏死。仅在禁食的APAP小鼠或喂食与半胱氨酸蛋白酶抑制剂联合治疗的小鼠中观察到肝细胞死亡导致的炎症细胞募集。肝脏炎症也与血清氧化HMGB1检测的缺失有关。HMGB1-中和抗体证实了HMGB1在诱导炎症中的重要作用。禁食和喂食小鼠之间的差异反应是基础肝ATP显著减少的结果，这阻止了半胱氨酸蛋白酶的处理，而不是谷胱甘肽耗竭或APAP代谢改变。因此，在药物诱导的肝毒性/肝病理过程中，通过空腹消耗ATP抑制caspase驱动的细胞凋亡和HMGB1氧化促进炎症反应。

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数字

图1
图1
禁食对APAP诱导小鼠肝细胞凋亡影响的组织学测定。（A，B）对照小鼠，PAS反应。（A） 在自由进食的对照小鼠中，绝大多数小叶中心肝细胞呈现胞质糖原（箭头所示）。（B） 禁食24小时的小鼠肝细胞内没有糖原。棒材=20μm。（C–F）APAP治疗后3小时（530 mg/kg）。在自由进食的动物（C、D）中，观察到小叶中心细胞丢失（平均得分1.1）。苏木精和伊红染色切片（箭头，C）中存在凋亡细胞，可根据其形态和裂解caspase-3的表达（箭头，D）进行鉴定。棒材=10μm。APAP给药前禁食24小时的动物表现出更广泛的肝细胞损失（平均得分1.6）。苏木精和伊红染色切片中发现坏死肝细胞（箭头，E）。肝细胞没有裂解胱天蛋白酶-3表达的证据，唯一阳性的凋亡细胞是分散的白细胞或库普弗细胞（箭头，F）。棒材=20μm。这些数字代表了三次独立调查中每组六只动物的情况。CV，中央静脉。
图2
图2
小鼠禁食24小时对（A）通过Western blot将肝procasase-3（p32）加工成活性形式（p17）和（B）APAP（530 mg/kg；5 h）诱导的肝DNA梯状排列的影响。小鼠禁食24 h对APAP治疗（530 mg/kg；5 h）后血清（C）K18凋亡片段水平（pmol/mL）、（D）HMGB1总含量（ng/mL）和（E）ALT活性（U/L）的影响。（F） APAP（530 mg/kg）对喂食（实线）和禁食（虚线）小鼠肝脏ATP含量的影响在0-5小时内进行了测定。数字具有代表性，数据以三项独立调查中每组六只小鼠的平均值±SD表示。统计显著性被指定为*P（P）< 0.05, **P（P）与时间匹配控件相比，<0.01。
图3
图3
与盐水处理（实线）相比，喂食雄性CD-1小鼠的肝脏GSH的DEM预完成（虚线）对APAP诱导的（530 mg/kg；0-5 h）凋亡和坏死细胞死亡的影响。具有代表性的（A）肝内原蛋白酶-3（p32）转化为活性形式（p17）的Western分析和（B）肝DNA阶梯的琼脂糖凝胶分析。GSH预耗竭对APAP诱导的（C）肝GSH耗竭、（D）肝ATP耗竭和血清（E）胱天蛋白酶切割的K18片段水平（pmol/mL）和（F）的影响APAP治疗后0-5h同时测定血清HMGB1含量（ng/mL）。数据以三项独立调查中每组六只小鼠的平均值±SD表示。相对于经溶媒治疗的对照组，分配了统计显著性(*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01和***P（P）<0.005）或DEM和盐水预处理小鼠之间（†P（P）<0.05）。
图4
图4
禁食雄性CD-1小鼠给予葡萄糖和甘氨酸（1000/100 mg/kg；APAP前1 h）对APAP诱导的（530 mg/kg，5 h）凋亡和坏死的影响。（A） 肝前蛋白酶-3的处理，（B）肝DNA阶梯，（C）肝GSH耗竭（nmol/mg），（D）血清caspase介导的K18片段水平（pmol/mL），（E）血清HMGB1总含量（ng/mL）和（F）血清ALT活性（U/L）。数字具有代表性，数据以三项独立调查中每组六只小鼠的平均值±SD表示。相对于车辆治疗的对照组或APAP单独与APAP+葡萄糖/甘氨酸之间分配了统计显著性(*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01和***P（P）< 0.005).
图5
图5
用APAP（530 mg/kg；5 h）剂量小鼠的血清表征半胱氨酸106 HMGB1的氧化状态。（A） 半胱氨酸106在小鼠HMGB1细胞因子域中的位置示意图，其特征为MS/MS。（B）非还原性SDS-PAGE分离和Western分析从喂食和禁食的APAP剂量小鼠（530 mg/kg；5 h）血清中通过免疫沉淀分离出的还原和氧化HMGB1，并通过LC-MS/MS进行特征分析。HMGB1也从Z-VAD.fmk预处理的APAP剂量小鼠中分离得到。（C） 含有半胱氨酸106磺酸的喂食APAP处理小鼠的氧化小鼠HMGB1肽97–112的MS/MS分析。（D） 对含有半胱氨酸106硫醇的还原小鼠HMGB1肽97–112进行MS/MS分析，该肽来自于预先放置24小时的APAP处理小鼠。MS/MS和Western图代表了在三项独立研究中每组六只小鼠的情况。
图6
图6
治疗24小时后，禁食、Z-VAD.fmk和抗HMGB1联合应用对APAP诱导的小鼠肝脏变化影响的组织学测定。（A） 在喂食的小鼠中，没有肝细胞坏死的证据，除了有丝分裂的肝细胞数量增加外，肝脏看起来没有变化（箭头）。没有证据表明炎症细胞募集到肝脏中。（B，C）治疗前24小时禁食的小鼠（B）和接受APAP+Z-VAD.fmk治疗的小鼠表现出明显的肝细胞丢失（评分3），内腔中出现中性粒细胞，并沿着中央静脉和门静脉的内皮细胞（箭头）滚动，表明白细胞重新聚集到肝脏中。（D） 在APAP治疗前，小鼠禁食24小时。中心静脉的近景，有许多中性粒细胞沿着内皮细胞滚动（箭头）。（E） ●●●●。禁食小鼠用APAP和抗HMGB1治疗与明显的肝细胞丢失（评分3）相关，但与炎症细胞重新聚集到肝脏无关。（F） 禁食小鼠经APAP和IgY治疗后；然而，可以看到明显的肝细胞丢失（评分3）和白细胞募集的证据，表现为中性粒细胞沿着中心静脉和门静脉的内皮细胞（箭头）滚动。苏木精和伊红染色。棒材=20μm。PA，入口区域；CV，中央静脉。这些数字代表了三次独立调查中每组六只动物的情况。
图7
图7
HMGB1中和对APAP（530 mg/kg；24 h）肝毒性的影响。在APAP治疗2 h后，用HMGB1-中和抗体或对照IgY抗体治疗小鼠，（a）24 h以上存活率（%）（喂饲小鼠+APAP，实线；禁食小鼠+APAP/IgY，大虚线；禁吃小鼠+APAPP/抗HMGB1，小虚线），（B）血清全长K18水平（pmol/mL），（C）血清ALT活性（U/L），（D）同时记录同一组小鼠血清总HMGB1含量、（E）血清TNF-α水平（pg/mL）和（F）血清IL-6水平（pg/mL）。数据代表了三项独立调查中每组六只小鼠的平均±SD。根据情况在各组之间分配统计显著性*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01和***P（P）<0.005。
图8
图8
概述本次调查结果的示意图。APAP在喂食CD-1小鼠模型中诱导肝细胞凋亡和坏死，可通过血清生物标记物K18进行量化。这伴随着半胱氨酸蛋白酶依赖的HMGB1氧化（HMGB1-SO三H） ，可以防止炎症反应。APAP前小鼠的禁食导致基础肝ATP水平的耗竭，这不允许细胞凋亡激活和HMGB1氧化。由此减少的HMGB1（HMGB1-SH）激活炎症细胞，并促进肝细胞死亡后的肝脏炎症反应，导致损伤加剧。
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