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.2010年11月5日；285(45):34885-98.
doi:10.1074/jbc。M110.148460。 Epub 2010年8月30日。

种子聚集和毒性α-突触核蛋白和tau：神经退行性疾病的细胞模型

野中隆 1, 渡边小久里, 岩手武士, 长谷川正人
附属公司

种子聚集和毒性{α}-突触核蛋白和tau：神经退行性疾病的细胞模型

野中隆等人。 生物化学杂志. .

摘要

淀粉样纤维在大脑中的沉积是神经退行性疾病发病机制中的中心事件。在这里，我们报道了α-synuclein胞质内包涵体的细胞模型，该包涵体是通过用转染试剂将成核种子导入SH-SY5Y细胞而产生的。将预制种子导入过度表达α-突触核蛋白的细胞后，细胞内形成大量高度丝状的α-突触核阳性内含物，这些内含物广泛磷酸化、泛素化和部分硫黄素阳性。形成这种包涵体的SH-SY5Y细胞经历了细胞死亡，细胞死亡被抑制β片形成的小分子化合物阻断。通过引入四重复Tau纤维，在表达四重复Tau-的细胞中观察到类似的种子依赖性聚集，而不是三重复Tau原纤维或α-联核蛋白原纤维。用四重复Tau纤维处理后，在过度表达三重复Tau的细胞中未观察到聚集形成。因此，我们的细胞模型为培养细胞内淀粉样蛋白的核依赖性和蛋白特异性聚合提供了证据。

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图1。
图1。
用脂质体试剂将种子α-syn导入培养细胞。 A类纯化的重组α-syn（可溶性形式；2μg）和纤丝（2μg。培养14h后，收集细胞并在SDS样品缓冲液中进行超声处理。煮沸后，用磷酸化依赖性抗α-syn Ser（P）免疫印迹法对样品进行分析129(PSer129型) (正确的)或磷酸化非依赖性抗体Syn102(左边).B类和C，羧基末端HA-标记的α-同原纤维种子(种子-HA)使用LA将其转导到细胞中。培养1天后(1天)或3天(三维)，用或不用胰蛋白酶采集细胞，用Tris-HCl从细胞中差异提取蛋白质(TS公司)，Triton®声波风廓线仪X-100(德克萨斯州)和Sarkosyl(萨尔)留下小球(幻灯片演示文件). 使用抗HA和抗Ser（P）对裂解产物进行免疫印迹分析129如图所示。抗HA或抗Ser（P）免疫反应带阳性129对Triton®声波风廓线仪X-100中的不溶性部分进行了定量。结果表示为平均值±S.E(n个= 3).D类共聚焦激光显微镜分析在LA存在下用Seed-HA处理的细胞。用2μg Seed-HA和5μl LA转导细胞。培养48小时后，固定细胞并用抗Ser（P）免疫染色129(绿色)和抗HA(红色)并用TO-PRO-3进行复染(蓝色).
图2。
图2。
经种子α-syn处理的质粒衍生α-syn-表达细胞中α-syn_内含物的共焦激光和电子显微镜分析。 A–DpcDNA3载体转染对照SH-SY5Y细胞的共聚焦激光显微分析(A类)，转染pcDNA3-α-syn的细胞(重量) (B类)，用种子α-syn转导的细胞(种子αS公司) (C)和转染pcDNA3-α-syn和SeedαS的细胞(重量+种子αS公司) (D类)，抗血清免疫染色（P）129(绿色)，并用TO-PRO-3复染(蓝色). 这个箭头表明用抗Ser染色的细胞质圆形内含物（P）129(第129页).比例尺，20微米。E–Fα-syn质粒和种子αS转染细胞的共焦图像比较(E类)和DLB脑组织切片(F类)使用抗Ser（P）129(绿色)和抗泛素抗体(红色). 转染细胞中的细胞质内含物(箭头)泛素阳性，像路易体(箭头)在DLB大脑中。比例尺，20微米。G公司和H（H）pcDNA3-α-syn和SeedαS转染细胞的共聚焦显微图像。细胞用0.05%硫黄素S染色(绿色)和抗血清（P）129抗体(红色). 这个装箱区上左边如所示右侧面板。比例尺，20μm左边和10μm正确的。我和J对转染pcDNA3-α-syn和SeedαS的细胞进行电镜分析。高倍放大装箱区域我如所示J.一个星号或箭头分别表示细胞核或线粒体。比例尺，2μm英寸我和200 nm英寸J·K用抗磷酸化Ser的多克隆抗体对转染pcDNA3-α-syn和SeedαS的细胞进行免疫电镜观察129α-合成物。比例尺200纳米。
图3。
图3。
培养细胞中细胞内α-syn聚集物的免疫印迹和免疫电镜分析。 A类和B类单用种子αS处理的细胞中α-syn的免疫印迹分析(种子αS公司)，仅pcDNA3-α-syn(重量)，或WT和种子αS(重量+种子αS公司). 用Tris-HCl从细胞中差异提取蛋白质(TS公司)，Triton®声波风廓线仪X-100(德克萨斯州)和Sarkosyl(萨尔)，留下颗粒(幻灯片演示文件). 使用抗α-syn（Syn102）检测斑点(A类)和抗血清（P）129(第129页) (B类).C–F类、免疫印迹分析从mock（none）或转染pcDNA3-α-syn的细胞中差异提取的蛋白质(重量)，用Seed-HA转导的细胞(种子HA+洛杉矶)或未经LA治疗(种子-HA−洛杉矶)和用Seed-HA处理过表达α-syn的细胞(重量+种子-HA+洛杉矶)或未经LA处理(重量+种子-HA−洛杉矶). 使用抗Ser（P）定量Triton X-100不溶部分磷酸化α-syn的免疫反应性129，结果表示为平均值±S.E(n个=3），如所示F类.a.u.，任意单位。G公司和H（H）、从转染细胞中提取的α-syn纤维的免疫电镜。用pcDNA3-α-syn和SeedαS转染SH-SY5Y细胞。从细胞中制备Sarkosyl不溶性部分，并用抗Syn102免疫标记纤维(G公司)或Ser（P）129(H（H）)抗体。比例尺200纳米。1天和三维分别为1天和3天。
图4。
图4。
α-Syn低聚物未引入培养细胞。 A类和B类α-Syn低聚物的制备如“实验程序”所述。用反相高效液相色谱法（Aquapore RP-300柱）分析与（47.8μg蛋白质）或不与exifone（30μg蛋白）孵育的低聚物α-Syn蛋白(A类). 这些样品（每个0.2μg蛋白质）也通过SDS-PAGE进行分析，并用抗Syn102免疫印迹(B类).C和D类，用空质粒转染细胞(没有人)或pcDNA3-αsyn（α同步器)然后用或不用α-syn低聚物处理(低聚物αS公司,5μ克)或纤维(种子αS公司,2μ克). 培养3天后，收集细胞，并进行免疫印迹分析。用Tris-HCl从细胞中差异提取的蛋白质(TS公司)，Triton®声波风廓线仪X-100(德克萨斯州)，萨科西尔(萨尔)，并使用抗Syn102探测颗粒（ppt）(C)和抗Ser（P）129(第129页) (D类).
图5。
图5。
α-syn突变对细胞内沉积的影响。单用pcDNA3-α-syn转染细胞中α-syns的免疫印迹分析(重量)，种子αS单独(种子αS公司)，WT和种子αS(重量+种子αS公司)和未处理的控制单元(没有人). 此外，还分析了家族性PD-linked A30P或A53T聚合缺陷Δ11突变α-syn过表达的细胞，以及随后用SeedαS转染的细胞。用Tris-HCl差异提取蛋白质(TS公司)，Triton-X(德克萨斯州)和Sarkosyl(萨尔)留下小球(幻灯片演示文件)用抗Syn102和Ser（P）进行免疫印迹129(第129页). Ser（P）129-图中所示的每种细胞类型的Sarkosyl可溶性和不可溶性部分中检测到的免疫反应带A类量化了(B类). 结果表示为平均值+S.E(误差线) (n个= 3). a.u.，任意单位。
图6。
图6。
细胞内α-syn内含物的形成导致的细胞死亡。 A类和B类，对照细胞的相控显微镜(A类)和转染pcDNA3-α-syn和SeedαS的细胞(B类)种子αS（20×目标）治疗后3天。C，通过LDH释放试验量化转染细胞的细胞死亡程度。单独转染α-syn质粒（WT、A30P、A53T、S129A或Δ11）或同时转染野生型或多个突变体和种子αS的细胞进行培养，3天后进行细胞死亡分析。结果表示为平均值+S.E(误差条) (n个= 5). *, 不显著；**，第页< 0.01; ***,第页<0.0005（学生）t吨根据种子αS值进行测试。D–F型α-syn的胞内聚集物导致蛋白酶体活性受损。D类非处理细胞连续提取蛋白质的免疫印迹分析(没有人)和仅转染野生型α-syn质粒的细胞(重量)或同时使用pcDNA3-α-syn和SeedαS(重量+种子αS公司)和用1μ米MG132使用抗泛素抗体16小时（MG132）。安箭头表示单体泛素。在Sarkosyl-soluble部分中观察到反映蛋白酶体活性受损的多泛素化蛋白质。TS公司，三溶性；德克萨斯州，1%Triton X-100可溶；萨尔，1%Sarkosyl可溶性；幻灯片演示文件不溶于Sarkosyl和不溶于SDS。E类蛋白酶体的肽水解活性。未处理对照细胞的细胞溶胶组分(没有人)，细胞仅转染野生型α-syn质粒(重量)或使用WT和种子αS(重量+种子αS公司)，用20μ米MG132持续4小时(毫克132)以苄氧羰基-Leu-Leu-Glu-7-氨基-4-甲基香豆素为底物制备并测定。结果表示为平均值+S.E(n个= 3). *,第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页<0.0005（学生）t吨根据none的值进行测试。F类，具有α-syn胞内聚集物的细胞中的蛋白酶体活性。用GFP-CL1和WT转染的SH-SY5Y细胞用种子αS处理2天，固定并用抗Ser染色（P）129在仅转染野生型α-syn质粒的细胞染色中(重量)，使用了抗Syn102。作为对照，还对未经处理或MG132处理的细胞进行染色和分析。在未经处理的对照细胞中，GFP的荧光检测较差，因为GFP-CL1可以被细胞内的蛋白酶体降解。与未经处理的细胞相比，经MG132处理的细胞的荧光显著增强，因为MG132抑制蛋白酶体活性。协同放大图像(箭头)两种GFP的强度都有所增加(绿色)以及抗Ser（P）的荧光129(红色)在转染WT和SeedαS的细胞中检测到(重量+种子αS公司)表明这些细胞中的蛋白酶体活性受到抑制。
图7。
图7。
淀粉样蛋白丝形成的小分子抑制剂可防止细胞内α-syn聚集体引起的细胞死亡。 A类种子αS和α-syn质粒转染细胞的细胞死亡(重量)和种子αS（有或无20或60μ）米棉籽蛋白，20或60μ米艾塞酮，60μ米槲皮素或60μ米利福平通过LDH释放试验定量。结果表示为平均值±S.E(误差线) (n个= 4). *, 不显著；**，第页< 0.05; ***,第页<0.0005（学生）t吨根据none的值进行测试。B类对转染种子αS和WT及种子αS的细胞制备的Sarkosyl不溶部分进行免疫印迹分析129(第129页)抗体。用20或60μ米转染种子αS后2 h，在多酚存在下培养3天。图中还显示了Tubulin-α负载控制。
图8。
图8。
细胞内Tau聚集体的免疫印迹分析。 A–C用Tau纤维单独处理（种子3R1N或种子4R1N）、pcDNA3-Tau单独处理（3R1N和4R1N，或种子Tau和pcDNA3-Tau共同处理）的细胞进行Tau的免疫印迹分析。用Tris-HCl从细胞中差异提取的Tau蛋白(TS公司)，Triton®声波风廓线仪X-100(德克萨斯州)和Sarkosyl(萨尔)和小球(幻灯片演示文件)用抗T46抗体进行探测(A类)，抗血清（P）396(第396页) (B类)，和抗AT100(C).
图9。
图9。
细胞内Tau聚集的细胞模型。 A–D，从转染细胞中提取Tau纤丝的免疫电子显微镜。用pcDNA3-Tau 3R1N和Seed 3R1N转染SH-SY5Y细胞(A类和B类)或pcDNA3-Tau 4R1N和Seed 4R1N(C和D类). 从细胞中制备Sarkosyl不溶部分，并用抗AT100免疫标记纤维(A类和C)或抗血清（P）396(PS396标准) (B类和D类)抗体。比例尺200纳米。E–G公司pEGFP空载体转染SH-SY5Y细胞的共聚焦激光显微分析(E类)，pEGFP-Tau 4R1N(F类)和转染pEGFP-Tau 4R1N和Seed 4R1N的细胞(G公司)，抗血清免疫染色（P）396(红色)，并用TO-PRO-3复染(蓝色).比例尺，10微米。
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