PI(3,5)P(2) controls membrane trafficking by direct activation of mucolipin Ca(2+) release channels in the endolysosome

doi:10.1038/ncomms1037

.2010年7月13日；1(4):38.

doi:10.1038/ncomms1037。

PI（3,5）P（2）通过直接激活溶酶体中粘蛋白Ca（2+）释放通道控制膜转运

仙萍洞¹, 东标申, 王翔（音）, 泰勒·道森, 李欣然, 张琪（音译）, 西平城, 张燕玲, 路易斯·魏斯曼, 马库斯·德尔林, 徐浩星

附属公司

PMID： 20802798
预防性维修识别码：项目经理2928581
内政部： 10.1038/ncomms1037

PI（3,5）P（2）通过直接激活溶酶体中粘蛋白Ca（2+）释放通道控制膜转运

仙萍洞等。国家公社. 2010.

.2010年7月13日；1(4):38.

doi:10.1038/ncomms1037。

作者

仙萍洞¹, 东标申, 王翔（音）, 泰勒？道森, 李欣然, 张琪（音译）, 西平城, 张燕玲, 路易斯·魏斯曼, 马库斯·德尔林, 徐浩星

附属

¹密歇根大学分子、细胞和发育生物学系，美国密歇根州安阿伯北大学830号3089国家科学大厦（克劳斯），邮编：48109。

PMID： 20802798
预防性维修识别码：项目经理2928581
内政部： 10.1038/ncomms1037

摘要

细胞内运输中的膜融合和分裂事件由管腔内Ca（2+）释放和磷酸肌醇（PIP）信号控制。然而，钙释放通道和PIPs靶蛋白的分子特性尚不明确。本文通过直接贴装内溶酶膜，我们报道了一种内溶酶特异性PIP PI（3,5）P（2）以特异性和效力结合并激活内溶酶-溶酶体放大的粘蛋白瞬时受体电位（TRPML）通道。PI（3,5）P（2）缺陷细胞和缺乏TRPML1的细胞在晚期内吞途径中均表现出溶酶体/空泡增大和转运缺陷。我们发现，在PI（3,5）P（2）缺陷小鼠成纤维细胞中观察到的增大的空泡表型受到TRPML1过度表达的抑制。值得注意的是，TRPML1依赖PI（3,5）P（2）的调节在进化上是保守的。在芽殖酵母中，高渗胁迫诱导Ca（2+）从液泡中释放。在这项研究中，我们发现这种释放需要PI（3,5）P（2）的产生和酵母功能性TRPML同源物。我们认为，TRPML通过将PI（3,5）P（2）水平的信息转换为近器官Ca（2+）的变化来调节膜转运，从而触发膜融合/裂变事件。

关键词：Ca2+释放通道；工厂1；PI（3,5）P2；PIKfyve公司；TRP通道；全内溶酶体记录；内体；溶酶体；膜贩运；磷酸肌醇；IV型粘液表皮病；液泡。

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数字

**图1。PI（3,5）P₂激活内溶酶体膜中的重组TRPML通道**
a）全基因组记录配置的图示。移液管（管腔）溶液是一种标准的外部（Tyrode’s）溶液，调节至pH 4.6，以模拟溶酶体管腔的酸性环境。浴（内/细胞质）溶液为K⁺-基溶液（140 mM K⁺-葡萄糖酸盐）。推测的TRPML通道的膜拓扑结构如晚期内体和溶酶体（LEL）所示。注意，向内电流表示阳离子流出内溶酶体（方向见红色箭头）。b）PI（3,5）P的镀液应用₂（diC8，100 nM）激活内向整流全基因组TRPML1介导的电流(我_TRPML1公司)在用液泡蛋白-1预处理的表达TRPML1-EGFP的Cos-1细胞的扩大内溶体/液泡中。我_TRPML1公司由重复的电压斜坡（−140至+140 mV；400 ms）引发，斜坡之间的间隔为4s。我_TRPML1公司在PI（3,5）P之前表现出较小的基础电流₂应用；PI（3,5）P的镀液应用₂内溶酶体的细胞质侧导致在一分钟内最大激活基线的18倍，在-140 mV我_TRPML1公司.c）代表性痕迹我_TRPML1公司之前（黑色）和之后（红色）PI（3,5）P₂在两个时间点，如中所示一（黑色和红色圆圈）。仅显示电压协议的一部分；保持电位=0 mV。d）PI（3,5）P的剂量依赖性₂-依赖激活（EC₅₀=48 nM，n=1.9）。e）PI（3）P（1µM）无法激活我_TRPML1公司.如果)PI（3,5）P对TRPML1的特异性激活₂（100 nM），但不包括其他diC8 PIP（均为1µM）。克)全基因组激活我_TRPML2型通过PI（3,5）P₂（1µM）。小时)全基因组激活我_{TRPML3号机组}通过PI（3,5）P₂（1µM）。我)全内溶酶体我_TRPML1-Va型表现出较高的基础活性，但对PI（3,5）P不敏感₂（100 nM）。j）全内溶酶体我_{TRPML1-R427P型}被PI（3,5）P弱激活₂.k）整个内溶酶体的基础电流振幅我_TRPML1公司,我_{TRPML1-R427P型}、和我_TRPML1-Va型.l）PI（3,5）P的影响₂在我_TRPML1公司,我_{TRPML1-R427P型}、和我_TRPML1-Va型.对于包括面板在内的所有图形的直方图(**f、 k、l**)在该图中，数据表示为平均值±标准误差（SEM）；n个数字在括号中。使用方差分析（ANOVA）进行统计比较：*P（P）*值<0.05被认为具有统计学意义，并用星号表示（*，0.01<*P（P）*< 0.05; **,*P（P）*<0.01；***，*P（P）*< 0.001).

**图2。PI（3,5）P₂激活内溶酶体膜中内源性TRPML样电流**
一)内源性内向整流类TRPML电流(我_TRPML1-L型)由PI（3,5）P激活₂（10µM）在从未转染的Cos-1细胞分离的液泡中。b)大PI（3,5）P₂-激活我_TRPML1-L型在从野生型（WT）人皮肤成纤维细胞分离的液泡中。**c（c）**)缺乏显著的PI（3,5）P₂-激活我_TRPML1-L型在从人类ML4（TRPML1）分离的液泡中^−/−)皮肤成纤维细胞。d日)内源性PI（3,5）P₂-激活我_{TRPML-L公司}WT和TRPML1中^−/−人成纤维细胞。统计分析：***，*P（P）*< 0.001; NS（无显著性），*P（P）*> 0.05).

**图3。PI（3,5）P下降₂通过螯合剂抑制内溶酶体膜中TRPML1通道的活性**
a）后PI（3,5）P₂准静态我_TRPML1公司通过向表达TRPML1-EGFP的Cos-1细胞中放大的内溶小体（内/细胞质）涂敷聚赖氨酸（500µg/ml）抑制。我_TRPML1公司随着添加100 nM PI（3,5）P而增加₂，但在冲刷后逐渐降低到准静态水平。b）代表性痕迹我_TRPML1公司在三个时间点，如所示一：根据PI（3,5）P₂涂敷（红色）、冲洗（黑色）和聚赖氨酸涂敷（品红色）。**c（c）**)对整个溶酶体缺乏聚赖氨酸（500µg/ml）影响我_TRPML1-Va型.d）后PI（3,5）P₂准静态我_TRPML1公司被镀液中和抗PI（3,5）P抑制₂（5µg/ml），但不含抗PI（4,5）P₂（5微克/毫升）。e）代表性痕迹我_TRPML1公司在三个时间点，如中所示d。 f）缺乏抗PI（3,5）P₂（5µg/ml）对全基因组的影响我_TRPML1-Va型.g、 h）大基底前-PI（3,5）P₂ 我_TRPML1公司被镀液中和抗PI（3,5）P抑制₂（5µg/ml），但不含抗PI（4,5）P₂.i）我_TRPML1公司通过浴（内质/细胞质）应用聚赖氨酸（500µg/ml）或PI（3,5）P抑制90%以上₂抗体。

**图4。PI（3,5）P下降₂易位脂类磷酸酶水平抑制内溶酶体膜TRPML1通道活性**
a）通过依赖于雷帕霉素的RFP-FRB-MTM1和EGFP-2*FKBP-Rab7异二聚体将MTM1招募到溶酶体膜。Rab7是一种LEL特异性Rab蛋白。MTM1是一种PI-3磷酸酶，可以转化PI（3,5）P₂和PI（3）P分别转化为PI（5）P和PI。b）RFP-FRB-MTM1和EGFP-2*FKBP-Rab7依赖于雷帕霉素的异二聚体改变了MTM1的亚细胞定位。用RFP-FRB-MTM1和EGFP-2*FKBP-Rab7转染Cos-1细胞。雷帕霉素（500 nM；20分钟）治疗促进MTM1-RFP与Rab7-EGFP的共定位。比例尺=10µm。**c-f）**MTM1对我_TRPML1公司Cos-1细胞与人TRPML1-myc、RFP-FRB-MTM1或RFP-FRB-MTM1-C375S和EGFP-2*FKBP-Rab7共转染。通过RFP-FRB-MTM1和EGFP-2*FKBP-Rab7依赖于雷帕霉素（500 nM）的异二聚作用将MTM1招募到LEL膜。c）我_TRPML1公司雷帕霉素治疗前，在MTM1转染细胞中。d）我_TRPML1公司雷帕霉素处理后的MTM1转染细胞。e）我_TRPML1公司在雷帕霉素处理后的MTM1-C357S转染的细胞中。f）WT和非活性突变体（C375S）MTM1对基础全基因组的差异效应我_TRPML1公司统计分析：*，0.01<*P（P）*< 0.05; **,*P（P）*< 0.01).

**图5。PI（3,5）P的直接结合₂TRPML1 N末端需要多个带正电荷的氨基酸残基**
a）TRPML1的细胞质N末端包含一个多碱区域和作为潜在PI（3,5）P的带正电氨基酸残基簇₂结合位点。本研究中突变为中性氨基酸Gln（Q）的带正电荷的氨基酸残基（Arg和Lys）显示为放大的圆圈及其氨基酸残基数。b）类蛋白质覆盖物。该条含有15种不同类型的油脂：PA、磷脂酸；S1P，1-磷酸鞘氨醇。三种纯化蛋白用于探针条带：GST单独（左面板）、GST融合到TRPML1的N末端片段（ML1-N-GST；右面板）和ML1-N-GST的Gln-取代突变体（ML1-7Q-N-GST；中间）。用抗GST抗体检测蛋白质。c）脂质体下拉试验。脂质体与纯化的GST融合蛋白孵育，离心，并用GST抗体通过Western blot观察相关蛋白。d）GST-ML1-N与与PI（3,5）P偶联的琼脂糖微球的结合₂，但不控制血脂；仅GST未能降低PI（3,5）P₂-共轭珠子。e）与GST-ML1-N相比，GST-ML1-7Q-N与PI（3,5）P的结合明显较弱₂-共轭琼脂糖珠。f）全内溶酶体我_{TRPML1-7Q公司}被高浓度的PI（3,5）P弱激活₂.g）PI（3,5）P₂剂量依赖性我_{TRPML1-7Q公司}虚线表示我_TRPML1公司（根据图1d报告）。h）大的基底全基因组我_{TRPML1-Va-7Q型}.在增益函数中引入电荷迁移Gln替代（7Q）*弗吉尼亚州*背景。i）GST-ML1-N肽（5µg/ml）降低PI（3,5）P₂-整个内溶酶体的依赖性激活我_{TRPML1公司·}.j）荷移Gln-取代取代（7Q）消除了GST-ML1-N肽的抑制作用。

**图6。钙²⁺高渗性休克后酵母液泡的释放依赖于PI（3,5）P₂生产**
a）代表性Ca²⁺在野生型（wt）中用aequorin介导的发光测量响应，*yvc1Δ*和PI（3，5P）₂-缺陷菌株(*真空度7Δ*,*真空14Δ*,*图4Δ*,*fab1Δ*)添加0.9M NaCl引起的高渗休克。b）定量数据显示不同酵母菌株对高渗休克的发光反应。折叠反应在电击前被归一化为基础发光。c）在野生型酵母中，高渗休克增加了液泡的数量，降低了液泡体积，但fab1突变酵母菌株没有。WT和*工厂1*用FM4-64染料标记Δ细胞，观察空泡体积和空泡叶数量。用0.45M NaCl处理细胞并用荧光显微镜观察。**d、 e）**YVC1在中的过度表达*工厂1*Δ细胞无法恢复高渗压诱导的钙²⁺响应。**f、 g）**的过度表达*FAB1型*在里面*工厂1*Δ细胞恢复高渗诱导的Ca²⁺响应。**h、 i）**在WT酵母细胞中过度表达TRPML1增加高渗诱导的钙²⁺响应。j）高渗性休克诱导钙空泡²⁺在中释放*vma3型*突变酵母菌株。k）TRPML1的过度表达，而不是孔突变TRPML1-KK（在pCu和pVT表达载体中）*yvc1型*Δ酵母细胞导致小而显著的高渗诱导钙²⁺响应。

**图7。TRPML1的过度表达挽救了PI（3,5）P内溶酶体表型的扩大₂-小鼠成纤维细胞缺陷**
**a、 b）**WT TRPML1和孔（ML1-KK）或PI（3,5）P过度表达的影响₂-对Vac14液泡数量和大小不敏感（ML1-7Q）突变体TRPML1^−/−成纤维细胞。培养真空14^−/−小鼠成纤维细胞表现出数量不等（1–20）的大（>3µm）空泡/内溶酶体。非V形细胞用星号表示。比例尺=20µm。b）TRPML1、ML1-KK和ML1-7Q蛋白共同定位于Vac14的Lamp1阳性区^−/−成纤维细胞。c）75%载体（mCit）转染Vac14中的大液泡^−/−成纤维细胞。Vac14-mCit或EGFP-ML1的过度表达将（增大的空泡）百分比降低至约15%，而75%的EGFP-ML-KK或EGFP-ML1-7Q转染细胞含有增大的空穴。d）Vac14中液泡大小/数量的直方图分析^−/−用指定的构建物转染成纤维细胞。e）分馏分析揭示了TRPML1和TRPML1-7Q与Lamp-1的共定位。使用超速离心获得梯度细胞分离。TRPML1和TRPML1-7Q蛋白都集中在Lamp1-rich组分中。

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