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.2010年8月5日；6（8）：e1001054。
doi:10.1371/journal.pgen.1001054。

发育时间开关促进轴突的生长，而不依赖于已知的导向受体

凯瑟琳·奥尔森-卡特 1, 弗兰克·J·斯莱克
附属公司

发育时间开关促进轴突的生长，而不依赖于已知的导向受体

凯瑟琳·奥尔森-卡特等。 PLoS基因. .

摘要

为了形成功能性的神经元连接，轴突的生长和引导必须在空间和时间上受到严格的调控。虽然许多基因和途径已被证明可以控制轴突发育的空间特征，但对指导轴突起始和延伸时间的体内机制知之甚少。秀丽隐杆线虫雌雄同体特异性运动神经元（HSN）在L4幼虫期先向腹侧延伸，然后向前延伸。这里我们显示lin-4 microRNA在细胞周期退出后促进HSN轴突的启动。在lin-4突变体中轴突无法形成，而在lin-4过度表达的动物中轴突过早生长。lin-4被要求下调两种HSN分化抑制剂——转录调节因子lin-14和“干细胞”因子lin-28——这可能是通过细胞自主机制实现的。这种发育开关既不依赖于UNC-40/DCC和SAX-3/Robo受体，也不依赖于轴突生长的方向，这表明它独立于腹侧引导信号来控制HSN轴突伸长的时间。

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数字

图1
图1。林-4（lf）显示HSN轴突延长延迟。
（A） 在晚期L3野生型（wt）动物（上图）中，HSN在腹侧方向（左图）延伸出多个神经突（箭头所示）。在L4早期（中）和成年（右），野生型动物先向腹侧，然后向前延伸单个HSN轴突。VNC：腹神经索。L3、L4和成人林-4（lf）动物（底部），未见典型的轴突或轴突。（B） L3、L4或成人野生型或林-4（lf）HSN轴突完成前转的动物。每个时间点n≥100。（C） 少数人之一的形象林-4（lf）轴突生长不良的成年动物（上图）。当放大盒子所包含的区域（底部）时，可以清楚地看到轴突直径的变化。（D） 细胞自主过度表达线-4O/E结构导致早期L3（i）突起生长，晚期L3（ii）轴突伸长，而对照结构的过度表达导致晚期L3的突起生长而非轴突伸长。（E） L3或L4期动物中轴突延伸的百分比线-4过表达（O/E）或控制（CON）线。全部线-4O/E（第3、4和5行）或对照（第2、7和17行）菌株含有unc-86：：myr-GFP记者想象轴突的生长。每个时间点n≥50。在A、C和D中，箭头指向PLM轴突，比例尺表示5µm，前部向左，腹部向下。在A（wt L3）、Di和Diii中，箭头指向几个轴突中的一个，在A（wt L4和成人）、C和Dii中，箭头指HSN轴突的前转向。对于B和E，误差条代表比例的标准误差。
图2
图2。第14行和第28行控制HSN轴突延伸的时间。
（A） 单个突变体临-14（lf）动物过早地伸展轴突，并将轴突加倍林-4（lf）;林-14（lf）突变体，林-14（lf）足以抑制林-4（lf）限制温度（23°C）下的迟缓表型。所有时间点的n≥50。（B）林-28（lf）动物表现出性早熟轴突发育不良林-28（lf）完全抑制了林-4（lf）迟缓表型。所有条件下n≥100。（C） 代表HSN来自林-14（lf）（i–ii）或林-28（lf）（iii–iv）早期L3动物出现多个腹侧神经突起的早熟生长（箭头，i，iii）或晚期L3阶段动物出现早熟轴突的生长（箭头、ii，iv）。箭头：PLM轴突。VNC：腹神经索。动物的前部位于左侧，腹部向下，比例尺代表5µm。（D） 过度表达第14行或第28行导致L4期轴突延伸显著延迟。***：野生型和两者之间的差异p<0.001第14行或第28行O/E使用双样本z测试。每个应变的n≥50。对于（A，B，D），误差条代表比例的标准误差。
图3
图3。线-4及其目标第14行和第28行在幼虫发育过程中相互表达。
（A） 在集成的线-4:：GFP报告菌株，GFP在幼虫发育期间在HSN中上调。y轴表示原始平均像素强度值，每个时间点的n=10。请注意，L1和成人阶段之间GFP表达水平的变化超出了相机的动态范围，并且在设定的曝光时间，只有L1、L2和L3的像素强度值始终在线性范围内。在L4晚期和年轻成人阶段获得的一些图像是过饱和的，因此L3后像素强度的变化可能是GFP表达真实折叠增加的低分辨率表现。EL1-4：幼儿早期1-4期。LL1-4：幼虫晚期1-4期。YAd：年轻人。（B） GFP表达林-14:：GFP在L2阶段，报告者在HSN中表达下调，而在林-4（lf）突变体，GFP表达保持不变**p值≤0.01（L2为0.005，L3为0.003）*p值=0.015。（C） A类线-28:：GFP报告菌株（Line 10-2）在L2和L3期HSN中表达下调。当它被穿过林-4（lf），GFP在幼虫发育过程中持续表达*p值=0.012***p值<0.001（2.5×10−5用于L3和6.3×10−7对于L4）。对于B和C，每个时间点的n≥10。注意，对于每个应变，L2、L3和L4的像素强度值被归一化为平均L1值，并且不表示绝对荧光强度。此外林-14:：GFP菌株表达GFP的能力弱于第28行报告者在L1期间，因此相对像素强度需要较小的降低才能完全下调林-14:：GFP转基因。使用双样本t检验获得相对像素强度差异的p值。在（A–C）中，所有误差条代表平均值的标准误差（S.E.M.）。（D） L1（顶部）和L4（底部）动物HSN的代表性图像线-4,第14行，或第28行GFP野生型记者或林-4（lf）背景如所述。箭头：HSN。比例尺代表5µm，前部位于左侧，腹部位于下方。
图4
图4。的规定第28行通过线-4和第14行随着发育时间的变化。
（A） 相对GFP水平较高线-28:：GFPΔLCE（第5-1行）缺乏LCE线-28:：GFP（线路10-2）在L2、L3和L4级具有完整的3′UTR**p值≤0.01（L2为0.005，L3为0.01，L4为0.002）。（B） 相对GFP强度在L3期较低线-28:：GFPΔLCE（第5-1行）缺乏LCElin-28:：绿色荧光蛋白（10-2号线）交叉进入林-4（lf）.*：p值=0.030。对于A–B，缺乏LCE或线-4超出了相机的动态范围。在设定的曝光时间，为L4晚期采集的一些图像过饱和。每个应变和时间点的n≥10。（C） 相对线-28:：GFP（第10-2行）在L2和L3期HSN中的表达较低林-14（lf）与23°C下的野生型相比。每个n≥9线-28:：GFP条件和n≥18林-14（lf）;线-28:：GFP条件。*：p值=0.019.**：p值=0.001。对于A–C，将数据归一化为每个菌株的L1值，使用双样本t检验获得相对像素强度差异的p值，误差条代表S.E.M.（D，E）代表L1-（D）和L4-stage（E）HSN线-28:：GFPΔLCE（第5-1行）。（F，G）代表性L1-（F）和L4-段（G）HSN来自线-28:：GFP（10-2号线）；林-14（lf）对于（D–G），比例尺代表5µm，前部向左，腹部向下。箭头：HSN。箭头：CAN神经元。
图5
图5。线-4自主调节HSN轴突延伸细胞。
（A） 含有林-4（lf）突变与整合unc-86：：myr-GFP记者被卷入线-4对过度表达（第3、4和5行）或对照（第2、7和17行）菌株以及L3和L4动物的轴突生长进行评分。显示了至少一个HSN中轴突延伸的动物百分比，每个阶段的n≥50。误差条表示比例的标准误差。（B，C）在具有线-4过表达结构，在L3早期HSN中检测到多个腹侧神经突起（B，箭头），在L4中晚期可见轴突生长（C，箭头）。VNC：腹神经索。（D，E）在表达对照构建体的动物中，在L3（D）或L4（E）阶段未检测到轴突或轴突。在（B–D）中，箭头：PLM轴突。（F） 在C中描绘的动物中林-4（lf）未挽救外阴表型，未观察到外阴发育（箭头）。（G） 从野生型中晚期L4动物发育的外阴（箭头）。（H–J）unc-86号机组启动子被用来驱动线-4发夹或缺乏成熟的控件线-4HSN中的序列。代表线-4过表达（O/E）（第4行）和对照（第7行）菌株杂交成线-28:：GFP携带其固有3'UTR的传感器（线路10-2）。在这两个线-4O/E和对照系，遗传转基因的HSN表达dsRED2标记。（H–I′）HSN的代表图像表示线-4O/E（H和H′）或对照（I和I′）结构，用GFP（BP）（H和I）或TRITC（H′和I′。B–I′中的比例尺表示5µm，前部在左侧，腹部在下方。（J） 来自线-4O/E和对照菌株。*：p值=0.021，使用两个样本t吨-测试两个平均值之间的差异。误差条代表S.E.M。
图6
图6。早熟轴突的生长不依赖于适当的引导。
（A） 含有强功能丧失（lf）或空等位基因的菌株unc-40号机组和萨克斯管-3对L3幼虫期是否存在轴突生长时间进行评分林-14（lf）在限制温度（23°C）下，林-14（lf）动物继续过早地伸展轴突unc-40（lf）,unc-40（空），或sax-3（空）突变背景。相比之下，单身unc-40型或萨克斯管-3突变体在L3期没有明显的生长。（B） 如果HSN轴突最初未能向腹侧方向延伸，则将其归类为误导性轴突。（C） L3级动物表达线-4过表达（O/E）结构显示早熟轴突延伸。在出现以下情况时，外生长无统计学意义的变化（p=0.45）：unc-40（lf）（D）在（C）中评分的HSN轴突的主要初始生长方向分为背侧（D）、腹侧（V）、前侧（A）或后侧（P）*p值=0.038***p值均<0.0001。对于（A，C），显示了至少一个HSN中轴突延伸的动物百分比，每个阶段的n≥50。对于（C，D），使用双样本z检验确定p值。对于（A–D），误差条表示比例的标准误差。
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