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.2010年10月1日；285(40):30463-71.
doi:10.1074/jbc。M110.156703。 Epub 2010年7月27日。

Nectin-Wnt途径导致肝星状细胞表观遗传过氧化物酶体增殖物激活受体γ阻遏

念玲朱 1, 王娇红, 冢本秀一（Hidekazu Tsukamoto）
附属公司

Nectin-Wnt途径导致肝星状细胞表观遗传过氧化物酶体增殖物激活受体γ阻遏

念玲朱等。 生物化学杂志. .

摘要

肝星状细胞（HSC）是储存维生素A的肝周细胞，通过肌纤维母细胞转分化或“激活”参与肝创伤愈合。这种细胞过程涉及脂肪生成转录因子（如过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ））的调控缺失。Necdin是一种黑色素瘤抗原家族蛋白，在抑制脂肪生成的同时促进神经元和肌细胞分化。本研究表明，necdin在不同肝细胞类型的HSC中选择性表达，并在体内外激活过程中诱导表达。用腺病毒表达的shRNA沉默necdin，以依赖PPARγ和抑制典型Wnt信号的方式将激活的HSC逆转为静止细胞。启动子分析、定点突变和染色质免疫沉淀证明Wnt10b是活化HSC中诱导的典型Wnt，是necdin的直接靶点。Nectin沉默消除了与PPARγ阻遏相关的三个表观遗传特征：增加了MeCP2（甲基CpG结合蛋白2）和HP-1α联合阻遏物对PPARγ启动子的再激活，并增强了外显子5位点的H3K27二甲基化，这同样依赖于抑制的典型Wnt。这些表观遗传效应是通过与Dikkopf-1的典型Wnt信号传导的拮抗来复制的。我们的结果证明了一种新的necdin-Wnt途径，该途径通过PPARγ的表观遗传阻遏作用介导抗脂原性HSC转分化。

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数字

图1。
图1。
Necdin mRNA(A类)和蛋白质(B类)在不同肝细胞类型的HSC中选择性表达。 千立方厘米，枯否细胞；秒窦内皮细胞；Hep公司，肝细胞。
图2。
图2。
在活化的HSC中诱导Nectin表达。 A类注意，随着HSC活化标记物α1（I）前胶原（α1（I）Procoll公司)抑制HSC静止标志物PPARγ。B类与静止的第1天细胞相比，培养7天的HSC中necdin蛋白水平显著增加，其方式与脂肪细胞的变化相同（脂肪细胞分化混合物MDI处理的3T3L1细胞）与前脂肪细胞（用溶剂DMSO处理的3T3L1）。C类，necdin诱导也在“体内从BDL或重复四氯化碳注射（CCl）诱导的纤维化大鼠肝脏中分离的活化“HSC4)同样伴随着α1（I）前胶原的诱导和PPARγ的下调。D类，necdin蛋白水平在BDL-或CCl活化的HSC中升高4-诱导性肝纤维化与相应对照组的比较，第页< 0.05; **,第页与第1天或对照组相比<0.01。误差线是标准偏差。
图3。
图3。
Nectin沉默以依赖PPARγ的方式将激活的HSC逆转为静止细胞。 A类与腺病毒表达shRNA对抗LacZ（Ad.LacZ.shRNA）的细胞相比，腺病毒表达的shRNA对抗necdin（Ad.necdin.shRNA）可有效降低培养激活的HSC中的细胞核和细胞溶质necdin水平。B类，在100 MOI下用Ad.necdin.shRNA沉默necdin，将活化的HSC恢复为具有静止HSC形态的细胞(相位)并通过紫外线激发的自体荧光评估增加细胞内维生素A的含量(紫外线)油红O染色的细胞内脂质含量(油红).C类α1（I）前胶原（α1（I）Coll公司).D类necdin沉默不影响神经元的表达(左边)或肌肉细胞(正确的)标记。E类培养激活的HSC中necdin沉默增加脂肪生成转录因子的表达(Ppar公司γ,C/ebp公司α、 和Lxr公司α） 以及它们的目标脂肪生成基因，Acc公司和Fas公司(左边). 与静止的第1天细胞相比，这些基因在培养激活细胞（第7天HSC）中均下调(正确的)necdin沉默后的诱导被认为是正常表达的恢复。F类Ad.Necdin.shRNA对活化HSC的形态学逆转被显性负性PPARγ的伴随表达完全消除(+广告.dnPPARγ） 通过相位对比显微镜和紫外线激发自荧光进行评估。Sma公司，平滑肌肌动蛋白*，第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页与相应的控制相比<0.005。误差线是标准偏差。
图4。
图4。
Nectin沉默减少规范（Wnt10b和Wnt3a）和非规范（Wnt4）Wnts的表达(A类)β-catenin的核水平(B类)在培养激活的HSC中。C类通过添加重组Wnt3a（100 ng/ml）可以阻止necdin沉默所实现的形态逆转到静止状态。D类，通过necdin沉默恢复的PPARγmRNA表达被Wnt3a阻断。*，第页与LacZ.shRNA相比<0.05；†，第页与不含Wnt3a的Necdin.shRNA相比，<0.05。
图5。
图5。
A类在50～200 MOI下用Ad.necdin.shRNA沉默necdin抑制重量10b肝星状细胞系（BSC）中的近端启动子（−705/+30）活性。B类，ChIP分析检测到necdin募集到两个最接近的ChIP位点（−143/+42和−268/−119），标记为重量10b第7天培养激活的HSC中的启动子感染了Ad.LacZ.shRNA。这些结合被Ad.necdin.shRNA沉默的necdin所消除。第1天静止的HSC显示出与这些位点的最小necdin结合。ChIP数据表示为与LacZ.shRNA诱导的第7天HSC最接近部位的最大募集相关。C类，Wnt10b近端启动子内潜在necdin结合GN盒在−108/−96:GG（T）GTGG（T）GGTGG，第页与Ad.LacZ.shRNA相比<0.05。
图6。
图6。
Nectin沉默减少表观遗传PPARγ阻遏。Necdin shRNA减少MeCP2(A类)和HP-1α(B类)绑定到Ppar公司外显子5位点的γ启动子和H3K27me2(C类)重组Wnt3a可消除这些影响(A–C). 腺病毒表达的Dkk-1在很大程度上减弱了MeCP2在Ppar公司γ启动子与第5外显子H3K27me2富集(D类)并恢复PPARγ表达(E类). *,第页与LacZ.shRNA或第1天Ad.GFP相比<0.05；†与不含Wnt3a或第7天Ad.GFP的Necdin.shRNA相比。
图7。
图7。
necdin-Wnt10b途径通过涉及MeCP2和H3K27me2的PPARγ的表观遗传抑制激活HSC。该示意图总结了我们的发现，necdin-mediated Wnt10b上调导致MeCP2招募增加至Ppar公司γ启动子和H3K27二甲基化增加Ppar公司γ位点伴随PPARγ阻遏和HSC激活。
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