14-3-3 binding to LRRK2 is disrupted by multiple Parkinson's disease-associated mutations and regulates cytoplasmic localization

doi:10.1042/BJ20100483

.2010年9月15日；430(3):393-404.

doi:10.1042/BJ20100483。

多个帕金森病相关突变破坏14-3-3与LRRK2的结合并调节细胞质定位

R杰里米·尼科尔斯¹, 尼古拉斯·扎姆科, 尼古拉斯·A·莫里斯, 大卫·G·坎贝尔, 玛丽亚·迪克, 阿尔班·奥杜鲁, 托马斯·马卡特尼, 友人通, 杰申, 阿兰·普雷斯科特, 达里奥·阿莱西

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DOI（操作界面）： 10.1042/BJ20100483

14-3-3与LRRK2的结合被多种帕金森病相关突变破坏，并调节细胞质定位

R杰里米·尼科尔斯等。生物化学杂志. 2010.

.2010年9月15日；430(3):393-404.

doi:10.1042/BJ20100483。

作者

R杰里米·尼科尔斯¹, 尼古拉斯·扎姆科, 尼古拉斯·A·莫里斯, 大卫·G·坎贝尔, 玛丽亚·迪克, 阿尔班·奥杜鲁, 托马斯·马卡特尼, 汤友仁, 杰申, 阿兰·普雷斯科特, 达里奥·阿莱西

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¹英国苏格兰邓迪大学。jnichols@parkinsonsinstitute.org

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摘要

LRRK2（富含亮氨酸重复蛋白激酶2）在大量帕金森病患者中发生突变，但对其如何调节或发挥作用仍知之甚少。在本研究中，我们证明了14-3-3蛋白亚型与LRRK2相互作用。与此一致，从瑞士3T3细胞或各种小鼠组织中分离的内源性LRRK2与内源性14-3-3亚型相关。我们已经确定，14-3-3结合是由位于富含亮氨酸重复结构域之前的两个保守残基（Ser910和Ser935）的LRRK2磷酸化介导的。我们的结果表明，Ser910和/或Ser935突变以破坏14-3-3结合并不影响固有蛋白激酶活性，而是诱导LRRK2在离散的细胞质池中积聚，可能类似于包涵体。为了研究14-3-3结合与帕金森病之间的联系，我们研究了41个LRRK2突变如何影响14-3-3的结合和细胞定位。引人注目的是，我们发现六种最常见的致病性突变中的五种（R1441C、R1441G、R1441A、Y1699C和I2020T）显著降低了Ser910/Ser935的磷酸化，从而干扰了与14-3-3的相互作用。我们还证明，在纯合LRRK2（R1441C）敲除小鼠的组织中，Ser910/Ser935磷酸化和14-3-3与内源性LRRK_2的结合显著降低。与14-3-3调节定位一致，所有显示14-3-3结合减少的常见致病突变在包涵体内积聚。我们还发现，在分析的41个LRRK2突变中，有3个显示出蛋白激酶活性升高（R1728H，约2倍；G2019S，约3倍；T2031S，约4倍）。这些结果提供了第一个证据，表明14-3-3调节LRRK2，并且LRRK2/14-3-3相互作用的中断可能与帕金森病有关。

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数字

**图1。定量MS确定14-3-3为LRRK2相互作用体**
在R6K4 SILAC培养基（GFP–LRRK2）或R10K8 SILAC介质[GFP–RLRK2（G2019S）]或正常R0K0 SILAC媒介（GFP）中培养稳定表达GFP的HEK-293细胞、野生型全长GFP–LFRK2或全长GFP-LRRK2[G2019S]突变体，进行多次传代。对细胞进行裂解，并从GFP和GFP–LRRK2中获得等量的裂解物(A类)或GFP和GFP–LRRK2（G2019S）(B类)是混合的。使用抗GFP抗体进行免疫沉淀，并在SDS/聚丙烯酰胺凝胶上电泳，该凝胶用胶体蓝染色(A类). LRRK2带的迁移用箭头表示，GFP带用箭头表示。分子质量标记（kDa）显示在凝胶的左侧。每个凝胶的整个通道都被切除，用胰蛋白酶消化，并进行MS处理。每个样品都用Orbitrap MS进行分析，并用MaxQuant（13.13.10版）进行定量[34]，结果汇总见右侧的表格。在GFP与野生型LRRK2的每次比较中，显示了与所示定量蛋白质相对应的肽数量和序列覆盖率，以及标记肽与未标记肽的富集比率（H/L比率）(A类)和带有LRRK2（G2019S）的GFP(B类). 显示了后验错误概率（PEP），它衡量MaxQuant量化的准确性，其中，越接近零，特定交互的概率越高[34]。

**图2。14-3-3和LRRK2相互作用的表征**
(A类)用对照IgG或抗LRRK2（S348C）抗体对瑞士3T3裂解物（5mg）进行免疫沉淀（IP）。用所示抗体（α）对免疫沉淀进行免疫印迹（IB）分析。(B类)用抗pan-14-3-3抗体对瑞士3T3裂解物（5 mg）进行免疫沉淀，并用所示抗体对免疫沉淀进行免疫印迹。(C类)用编码GST（谷胱甘肽转移酶）的pEBG质粒或显示的GST标记的14-3-3亚型转染稳定表达FLAG–LRRK2[11]的T-REx HEK 293细胞，并通过在培养基中加入1μg/ml多西环素诱导表达LRRK2。转染后（36 h），细胞被裂解，谷胱甘肽-Sepharose亲和性纯化蛋白用所示抗体进行免疫印迹。(D类)用抗LRRK2（S348C）从瑞士3T3细胞中免疫沉淀内源性LRRK_2，然后在没有或存在EDTA的情况下用λ磷酸酶处理，然后用所示抗体进行免疫印迹分析或14-3-3重叠分析。(E类)如中所示(D类)但实验是用瞬时转染HEK-293细胞后获得的免疫沉淀FLAG–LRRK2进行的。

**图3。序号⁹¹⁰和Ser⁹³⁵磷酸化介导LRRK2与14-3-3的结合**
(A类)用来自瑞士3T3细胞的抗LRRK2-（100–500）（S348C）抗体免疫沉淀内源性LRRK2，用来自稳定诱导的T-REx HEK-293细胞的抗FLAG琼脂糖免疫沉淀FLAG–LRRK2。免疫沉淀物在4–12%Novex SDS/聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，并用胶体蓝染色。这种凝胶是几种实验的代表。LRRK2胰蛋白酶肽在LTQ-Orbitrap质谱仪上进行LC-MS/MS分析。M、分子标记。(B类)LTQ-Orbitrap MS鉴定的磷酸肽以表格形式显示。观察到的质量(米/*z（z）*)显示了预测质量（M），并确定了磷酸化位点和肽序列。评估的实验数量(N个)在柱的顶部指示，并指示磷酸化肽被鉴定的总次数。(C类)LRRK2的结构域按比例呈现，氨基酸残基表示域边界。显示了已识别的磷酸化位点的位置。LRR，富含亮氨酸重复序列。(D类)在(A类)和(B类)突变为丙氨酸残基并在HEK-293细胞中瞬时表达。用抗FLAG–琼脂糖免疫沉淀LRRK2，用FLAG（总量）探测等量的每个蛋白，并用重叠分析评估直接结合14-3-3的能力。14-3-3和Hsp90联合免疫沉淀（co-IP）通过免疫印迹法用所示抗体测定。针对30μM Nictide测定激酶活性，并通过使用Odyssey系统的定量免疫印迹校正免疫沉淀物中蛋白质水平的磷酸盐掺入量来测定比活性，以c.p.M/吸光度单位（cpm/LICOR AU）表示。这些数据是重复实验的平均值，重复实验四次，结果相似。(E类)链霉亲和素-琼脂糖与生物素化的二磷酸化肽结合⁹¹⁰（pS910）和Ser⁹³⁵（pS935），并在存在或不存在λ磷酸酶的情况下，在存在或没有EDTA磷酸酶抑制剂的情况下培养。然后将琼脂糖珠与HEK-293细胞裂解物孵育，并在广泛清洗珠并进行14-3-3免疫印迹分析后评估14-3-3的相互作用。(F类)通过瞬时转染在HEK-293细胞中表达所示形式的FLAG–LRRK2。转染后（36小时），用抗FLAG抗体进行免疫沉淀，并用抗Ser的磷酸特异性抗体进行免疫印迹⁹¹⁰（S357C）和序列号⁹³⁵（S814C）。免疫沉淀物与14-3-3的直接结合也通过14-3-3重叠试验进行评估，14-3-3和Hsp90的共同免疫沉淀通过与相应抗体的免疫印迹进行评估。美国。，未经改造。(**G公司**)从野生型雄性C57BL/6小鼠的组织中免疫沉淀LRRK2，并免疫印迹检测血清⁹¹⁰和Ser⁹³⁵磷酸化和14-3-3结合通过重叠试验进行评估(F类). (小时)LRRK2的多序列比对智人（NP_940980），*黑猩猩*（XP_001168494），*小家鼠*（NP_080006），*褐家鼠*（XP_235581），*Bos金牛*（XP_615760），家犬（XP_543734）和*五倍子*（XP_427077）。磷酸化残基Ser的位置⁹¹⁰和Ser⁹³⁵显示。相同的残留物用灰色表示。(我)Ser周围残基的序列比较⁹¹⁰和Ser⁹³⁵人LRRK2的磷酸化位点。

**图4。14-3-3结合影响LRRK2细胞质定位**
(A类)用0.1μg/ml多西环素诱导含有指定形式LRRK2的稳定可诱导T-REx细胞系24小时，以诱导GFP–LRRK2.的表达。用抗GFP抗体对来自每个突变体诱导细胞的等量细胞裂解物进行免疫印迹分析，以检测融合蛋白或抗GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）抗体作为负荷对照。(B类)显示了代表所示形式GFP–LRRK2培养物的荧光显微照片。在非14-3-3结合突变体中观察到的GFP–LRRK2细胞质池用白色箭头表示。

**图5。41个PD-相关LRRK2突变体的活性和14-3-3结合**
插图显示了LRRK2的结构域，并注释了富含亮氨酸重复序列（LRR）、ROC结构域、COR结构域、激酶催化结构域（kinase）和最小WD40重复结构域（WD40）。显示了PD相关突变的位置。指出了结构域的氨基酸边界。全长FLAG标记的LRRK2的指示变体在HEK-293细胞中瞬时表达，并进行免疫沉淀分析。针对LRRKtide评估免疫沉淀物的激酶活性，并使用Odyssey系统通过LRRK2的定量抗FLAG免疫印迹分析确定比活性，并定义为c.p.m/吸光度单位。野生型LRRK2活性设置为1，突变活性与野生型相关。对三个实验进行了两次分析，并表示为平均值±S。E.M.FLAG–LRRK2免疫沉淀物也用抗FLAG、抗磷酸化-Ser进行免疫印迹分析⁹¹⁰（pS910）和抗磷-Ser⁹³⁵（pS935）抗体。14-3-3与LRRK2变异体的结合通过14-3-3远西部印迹分析和14-3-3免疫印迹共沉淀（co-IP）14-3-3进行评估。

**图6。Ser的中断⁹¹⁰/序号⁹³⁵LRRK2（R1441C）敲除小鼠的磷酸化和14-3-3结合**
从三只纯合LRRK2（R1441C）敲除小鼠和三只野生型同窝对照小鼠以及液氮冷冻的snap中快速切除脑、肾和脾组织。LRRK2从大脑、肾脏或脾脏的全组织裂解液中免疫沉淀。免疫沉淀被免疫印迹以检测血清中LRRK2的磷酸化⁹¹⁰和Ser⁹³⁵以及总LRRK2。通过14-3-3远Western blot分析评估与14-3-3结合的相互作用能力。注意，用于测定血清Ser的脾脏样本不足⁹¹⁰磷酸化。

**图7。41个PD-相关LRRK2突变体的定位**
用1μg/ml多西环素诱导含有所示突变的稳定可诱导T-REx细胞系的平行培养24小时，以诱导GFP–LRRK2的表达。上面板，使用抗GFP抗体对来自每个突变体诱导细胞的等量细胞裂解物进行免疫印迹分析，以检测融合蛋白或抗ERK1（细胞外信号调节激酶1）抗体作为负荷对照。分子质量显示在左侧（kDa）。下面板显示了代表每个PD-相关突变体培养物的荧光显微照片（面板1-43）。GFP–LRRK2的细胞质池用白色箭头表示。在两个独立生成的稳定细胞系上进行了两次定位分析。所示每个显微照片的较大面板如补充图S1所示http://www.BiochemJ.org/bj/430/bj4300393add.htm).

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中的注释

14-3-3蛋白是有前景的LRRK2相互作用因子。
Rudenko IN，Cookson先生。 Rudenko IN等人。《生物化学杂志》2010年9月15日；430（3）：e5-6。doi:10.1042/BJ20101200。生物化学杂志2010。采购管理信息：20795948
LRRK2和泛素化：激酶抑制剂治疗的意义。
梅尔罗斯HL。梅尔罗斯HL。《生物化学杂志》2015年9月15日；470（3）：e21-4。doi:10.1042/BJ20150785。《生物化学杂志》，2015年。采购管理信息：26341487 免费PMC文章。

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