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.2010年8月；12(8):747-57.
doi:10.1038/ncb2078。 Epub 2010年7月18日。

质膜有助于形成自噬前结构

布林达·拉维库马尔 1, 凯文·莫罗, 卢卡·贾赫里斯, 克劳迪娅·普里, 大卫·C·鲁宾斯泰因
附属公司

质膜有助于形成自噬前结构

布林达·拉维库马尔等。 Nat细胞生物学. 2010年8月.

勘误表in

  • 自然细胞生物学。2010年10月；12(10):1021

摘要

自噬是一个分解代谢过程，溶酶体降解双膜自噬体中运输的胞质内物质。自噬体是由吞噬细胞的伸长和融合形成的，吞噬细胞来源于自噬前结构。自噬体的膜起源尚不清楚，可能涉及多种来源，包括内质网和线粒体。这里我们在哺乳动物细胞中显示，网格蛋白重链与Atg16L1相互作用，并参与Atg16L阳性早期自噬小体前体的形成。Atg16L1与网格蛋白包被结构相关，并且抑制网格蛋白介导的内化减少了Atg16L阳性前体和成熟自噬体的形成。我们测试并证明，质膜直接参与早期Atg16L1阳性自噬体前体的形成。在自噬体形成增加的时期，这一点可能特别重要，因为质膜可以作为一个大的膜贮存器，允许细胞在比基础条件下高出四倍的水平上合成自噬小体，而不影响其他过程。

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数字

图1
图1。Atg16L1与氯氰菊酯重链相互作用
答：。用对照中的Atg16L1抗体（Atg16L1）或无抗体（no Ab）免疫沉淀HeLa细胞裂解物，进行SDS-PAGE，并根据制造商的方案用SimplyBlue安全染色剂（Invitrogen）对蛋白质进行染色。切下盒子中显示的条带，用胰蛋白酶消化，并用MALDIToF鉴定。B。将转染对照载体或Flag-Atg16L1野生型或不同缺失突变体（2-77、2-275、232-607）的HeLa细胞转染24小时后，用抗Flag抗体（Atg16L1）免疫沉淀，并用抗甲氰菊酯、抗Flag-和抗Atg5抗体免疫印迹。氯氰菊酯与Atg16L1的N-末端相互作用，类似于Atg12-Atg5。将总裂解物作为蛋白质输入的对照。C、。HeLa细胞裂解物用Atg16L1抗体（+Ab）或无抗体（no-Ab）免疫沉淀（IP），用抗甲氰菊酯、抗AP2和抗Atg16L抗体免疫印迹。输入对照品的总细胞裂解物（TL）也被吸光。内源性Atg16L1与氯氰菊酯重链和AP2相互作用。D。转染Flag-Atg16L1和增加Atg5浓度24h的HeLa细胞用抗Flag抗体（Atg16L1）进行免疫沉淀（IP），并用抗氯氰菊酯、抗Flag和抗Atg5抗体进行免疫印迹。Atg5过度表达既不干扰也不增加氯菊酯-Atg16L1结合。TL–总细胞裂解物。
图2
图2。抑制网格蛋白介导的内吞减少自噬体的形成
答：。转染两轮对照、epsin 1、clathrin重链、AP2或AP1 siRNA的HeLa细胞5 d后，要么不处理，要么用Bafilomycin A1（+/-BafA1）处理4 h，然后用抗LC3和抗ubulin抗体进行western blot分析。注意，在我们使用的蛋白质提取条件下，与HeLa细胞中的LC3-II相比，LC3-I通常非常微弱。但这不是问题，因为建议将LC3-II与微管蛋白/肌动蛋白联系起来。B。LC3-II与对照组、epsin、clathrin重链、AP2或AP1敲除后的微管蛋白的比率，无论是否使用Bafilomycin A1，都是通过三个独立实验（两个实验用于epsin）进行量化的，并在图中表示。*-p<0.01，**-p<0.001，***-p<0.0001。C、。将稳定表达GFP-mRFP-LC3的HeLa细胞转染两轮对照或克拉通重链siRNA，转染5 d，在此期间，未经处理（UT）或用Bafilmycin A1（BafA1）处理15 h。然后将细胞固定并在细胞组学阵列扫描系统上进行分析。图中显示了不同条件下每个细胞自噬空泡（AV）或自溶体（AL）的定量p<0.01，NS-不显著。n=2000个单元。D。将转染有对照、氯氰菊酯重链、AP1或AP2 siRNA的HeLa细胞在Hanks平衡盐溶液（HBSS）中培养4d，6h后固定细胞，并进行内源性LC3免疫染色。具有50个以上LC3-囊泡（用箭头标记）的HeLa细胞的百分比如图所示。***-p<0.0001。n=500个单元。图中的所有误差条代表SEM。
图3
图3。网格蛋白介导的内吞作用对Atg16L1阳性自噬体前体的影响
A、 B、C、D。转染对照、epsin 1、clathrin重链、AP2或AP1 siRNA的HeLa细胞72 h后，用Hanks平衡盐溶液处理6 h（诱导自噬），然后固定并免疫染色内源性Atg16L1。定量具有Atg16L1囊泡的HeLa细胞的百分比。***-p<0.0001。比例尺–10μm。（请注意，我们在所有实验中使用了单个siRNAs，并且通过氯氰菊酯重链的两个独立序列证实了其效果）。n=600个电池。E。F。将转染Flag标记野生型Atg16L1或Atg16L2缺失突变体-2-275或232-607 Atg16L的HeLa细胞固定24小时，并用抗Flag抗体进行模拟，定量并在图中表示带有Flag-Atg16L1囊泡的细胞比例。顶部面板显示了具有不同突变结构的Atg16L1囊泡的代表性图像。NS–不显著，***-p<0.0001。n=100个单元。G、 H，I。用GFP-Atg16L1和tomato-LC3进一步转染转染对照组、epsin 1、clathrin重链、AP2或AP1 siRNA的HeLa细胞24小时，然后固定细胞。GFP-Atg16L1（绿色）与tomato-LC3小泡（红色）共定位（黄色，用箭头标记）的百分比如图所示进行量化。n=21个单元格。***-p＜0.0001。比例尺–10μm。图中的所有误差条代表SEM。
图4
图4。Atg16L1小泡靠近质膜
答：。转染GFP-Atg16L1 24小时的HeLa细胞被固定，以显示Atg16L2小泡（绿色）。比例尺–10μm。B。瞬时转染GFP-Atg16L1和mRFP-GPi的HeLa细胞在饥饿培养基中培养20 h，再培养2 h。显示带有GFP-Atg 16L1（绿色）和mRFP-GPi（红色）的TIRF图像。箭头表示Atg16L1和GPi之间的共同定位。GFP-Atg16L1与mRFP-GPi共定位的百分比如图所示。n=2。比例尺–5μm。C、。转染GFP-Atg16L1的HeLa细胞24小时后，要么不治疗，要么用50μM dynasore（Sigma）处理4小时，然后用抗GFP（15 nm金颗粒）和抗甲氰菊酯（10 nm金颗粒”）抗体处理免疫金EM。在装箱区域可以看到协同放大。与Atg16L1/1000μM相关的氯氰菊酯涂层结构（CCS）的定量2如图所示。***-p<0.0001。比例尺–100 nm。图中的所有误差条代表SEM。
图5
图5。Atg16L1囊泡与霍乱毒素B亚单位标记的囊泡共定位
答：。转染GFP-Atg16L1（绿色）和CFP-LC3（蓝色）的HeLa细胞在4°C下与Alexa fluor-555结合的霍乱毒素亚基B（红色）孵育15分钟（允许毒素与质膜结合）。然后将细胞在37°C（允许霍乱毒素内化）下孵育10分钟，并固定以进行共聚焦分析。Atg16L1和霍乱毒素阳性的水泡呈黄色（也可参见高倍图像）。请注意，与霍乱毒素共定位的小Atg16L1囊泡对LC3为阴性（用黄色箭头标记），与霍毒毒素和LC3共定位的Atg16L1囊泡（用蓝色箭头标记）显示在右侧放大的面板中。比例尺–10μm。B。将转染GFP-Atg16L1（绿色）的HeLa细胞与Alexa fluor-555结合的霍乱毒素亚基B（红色）孵育24小时，如A类固定后，对其进行内源性EEA1（蓝色）免疫染色，并通过共焦显微镜进行分析。Atg16L1和霍乱毒素B阳性的囊泡为黄色（白色箭头），EEA1和霍乱毒阳性的囊胞为紫色（蓝色箭头），并在高倍图像中显示。图表显示了共同本地化的百分比。n=20个电池。比例尺–10μm。C、。用HBSS处理HeLa细胞6小时后，将Alexa fluor-555标记的霍乱毒素亚基B（红色）培养为A类然后固定细胞，并对内源性Atg16L1（绿色）和内源性EEA1（蓝色）进行免疫染色。细胞分析如下B类图中显示了定量。比例尺–10μm。箭头显示Atg16L1-cholera毒素共同定位。三角图显示EEA1-cholera毒素共同定位。n=20个电池。D。用HBSS处理HeLa细胞6小时后，与Alexa fluor-555标记的霍乱毒素亚基B（红色）一起孵育，如A类然后固定细胞，并对内源性Atg5（绿色）或内源性Atg 12（绿色）进行免疫染色。Atg5（n=18个细胞）或Atg12囊泡（n=39个细胞）与霍乱毒素的共定标以黄色（箭头）显示并在图表中量化。比例尺–10μm。图中的所有误差条代表SEM。
图6
图6。Atg16L1野生型和缺失突变体的分析
答：。用Flag标记的野生型Atg16L1或Atg16L缺失突变体2-275或232-607 Atg16L2与GFP-Atg5和CFP-LC3转染HeLa细胞24小时后，在共聚焦分析前用抗Flag抗体进行固定和模拟。插图中的箭头标记了野生型或2-275 Atg16L1（红色）与GFP-Atg5（绿色）的协同缩放。比例尺–10μm。B。将转染GFP-Atg16L1的HeLa细胞与HRP-结合的霍乱毒素亚基B在4°C下孵育15分钟。然后将细胞在37°C下培养10分钟，然后用EM.PM质膜的抗HRP抗体（15 nm金颗粒）和抗GFP抗体（10 nm金粒子）对其进行双重免疫金标记。比例尺–100 nm。在装箱区域可以看到协同放大。n=49个字段。图中的所有误差条代表SEM。
图7
图7。质膜参与Atg16L1阳性自噬体前体
答：。转染GFP-Atg16L1（绿色）24小时的HeLa细胞在37°C下用CellMask橙色质膜染色培养5分钟，然后立即成像（在37°C的培养室中）。显示了CellMask橙色囊泡（红色）与GFP-Atg16L1囊泡（绿色）融合后的时间序列。比例尺–5μm。顶部和底部面板中还显示了一幅放大倍率较高的图像，显示GFP-Atg16L1囊泡（绿色）与CellMask橙色阳性囊泡（红色）的共定位（黄色），并用箭头标记。B、 C、。随后将转染对照、氯氰菊酯重链、AP1或AP2 siRNA 72 h的HeLa细胞转染GFP-Atg16L1（绿色）和siRNA 24 h。然后将细胞与Alexa fluor-555结合的霍乱毒素亚基B（红色）在4℃孵育15分钟，然后在37°C下进一步培养10分钟，然后固定细胞进行共聚焦分析。图中显示了GFP-Atg16L1（绿色）与霍乱毒素（红色）在对照组或氯氰菊酯重链敲除中的共定位（黄色），这在图中进行了量化C类.n=25个单元格。***-氯氰菊酯重链KD的p=0.0002，AP2 KD的<0.0001。图中的所有误差条代表SEM。比例尺–5μm。
图8
图8。内吞小泡断裂对吞噬细胞形成的影响
答：。收集转染两轮对照、氯氰菊酯重链或AP2 siRNA的Hela细胞4d，用抗Atg16L1抗体（IP）进行免疫沉淀。使用抗Atg16L1和抗网格蛋白抗体对总裂解物（底部）和IP（顶部）进行Western blot。注意Atg16L1-Clathrin与AP2击倒的相互作用减少。图中显示了Atg16L1-板球蛋白或Atg16L2-AP2的定量，以及两个独立实验中的对照、氯氰菊酯重链或AP2敲除。B。用Flag标记的野生型Atg16L1、GFP-PLC（PH）和空载体（Control）或显性负性dynamin-II突变体（K44A dynamin；DN-Dyn）转染HeLa细胞24小时后，用共聚焦显微镜进行固定和分析。注意Atg16L1与PLC（PH）在质膜上的共定位，这在图中进行了量化。*-p<0.01。比例尺–5μm。n=20个电池。C、。收集单独用HBSS处理的Hela细胞或用80μM dynasore处理的HBSS处理5h的Hela淋巴细胞，用抗Atg16L1抗体（IP）进行免疫沉淀。使用抗Atg16L1和抗网格蛋白抗体对总裂解物（TL）和IP进行Western blot分析。注意Atg16L1-Clathrin与dynasore治疗的强相互作用。图表显示了两个独立实验的定量结果。图中的所有误差条代表SEM。D。质膜对自噬体前体形成的贡献。霍乱毒素通过依赖于氯氰菊酯和非依赖于氯溴菊酯的内吞作用被内化。氯菊酯击倒显著降低霍乱毒素的摄入。从质膜（EEA1-阴性）立即萌芽的氯氰菊酯包被囊泡（CCV）是早期内体（EE）（EEA1阳性）的前体。先前的研究表明，将完全形成的自噬体输送到溶酶体需要将这种自噬小体与早期或晚期内体/多泡小体（LE/MVB）融合，以形成两性体，它们是Atg16L1-阴性、LC3-阳性和内体标记阳性（红色箭头）。我们在这里表明，对网格蛋白依赖性内化的抑制抑制了早期Atg16L1阳性前体的形成，这些前体成熟形成吞噬体和后来的自噬体（蓝色箭头）。这些Atg16L1-vesicles对其他早期自噬体标记物（Atg5和Atg12）阳性，但对早期内吞体标记物不阳性（EEA1）。AP2是质膜上的网格蛋白适配器，而AP1定位于TGN和内体。
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中的注释

  • 质膜使自噬体复活。
    Cuervo上午。 Cuervo上午。 自然细胞生物学。2010年8月；12(8):735-7. doi:10.1038/ncb0810-735。 自然细胞生物学。2010 PMID：20680002 没有可用的摘要。
  • 自噬：链条中的一个新环节。
    沃克·D·。 沃克·D·。 Nat Rev摩尔细胞生物学。2010年9月；11(9):604-5. doi:10.1038/nrm2954。Epub 2010年8月4日。 Nat Rev摩尔细胞生物学。2010 PMID：20683468 没有可用的摘要。

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